Генетические манипуляции

Общая цель данной процедуры заключается в эффективной и надежной замене генов с использованием штаммов Toxoplasma gondii типа один и типа два delta 2 80. Это достигается путем первоначального конструирования таргетной молекулы ДНК, в которой селективный маркер HX GPRT в прямой ориентации объединяется между специфическими 5'- и 3'-фланкирующими последовательностями ДНК для таргетинга гена. Вторым этапом процедуры является трансфекция таргетной молекулы ДНК в штамм Toxoplasma gondii типа один или типа два.

Третьим этапом является терпеливый отбор событий двойного кроссинговерного гомологичного рекомбинирования и изоляция отдельных клонов. Заключительный этап заключается в подтверждении события целевого воздействия на ген в изолированных мутантных клонах. В конечном счете, результаты данной процедуры позволяют определить функцию генов паразита путем анализа направленного нокаута генов, замены генов и использования меченых генов с помощью различных последующих методов анализа.

Основным преимуществом данной методики по сравнению с существующими методами, использующими штаммы этого паразита дикого типа, является то, что генетические фоны паразитов типа один и типа два delta two 80 теперь позволяют осуществлять чрезвычайно надежный отбор направленных событий двойного кроссинговера при гомологичной рекомбинации для создания точных генетически определенных штаммов. Эта методика значительно ускорит поиск новых мишеней для лекарственной терапии антитоксическими плазмами и разработку безопасных и эффективных аттенуированных вакцинных штаммов, особенно в сочетании с продуманными геномными ресурсами, доступными онлайн на сайте toxodb.org. Как правило, лицам, впервые применяющим данный метод, может быть сложно сконструировать направленные молекулы ДНК или выполнить генетические манипуляции с Toxoplasma Gandhi.

Тем не менее, успех будет обеспечен при надлежащей практике пациентов и разработке надежных молекул таргетинга. Начните выполнение протокола с ПЦР-амплификации 5'- и 3'-геномных флангов таргетинга для интересующего гена из геномной ДНК. Затем с помощью ПЦР амплифицируйте селективный маркер HX GPRT с его 5'- и 3'-флангами DHFR из минигенной кассеты HX GPRT CD NA.

Используйте рекомбинацию в дрожжах или аналогичный метод для слияния молекул 3D NA в правильной ориентации от 5'- к 3'-концу с плазмидой PRS 416, чтобы создать плазмиду p delta GOI, предназначенную для делеции целевого гена. Затем приготовьте образец объемом 100 µL, содержащий от 15 до 30 µg линеаризованной таргетной плазмиды, для трансфекции в T gia через 68–72 часа после инокуляции 25 см колбы с конфлюэнтными клетками HFF. Подтвердите наличие свежелизатированных паразитов, визуально убедившись, что 90–95% клеток HFF подверглись лизису; жизнеспособные паразиты необходимы для таргетного воздействия на ген.

Перемешайте жизнеспособных паразитов в растворе, энергично встряхивая закрытую колбу, чтобы жидкость не попала на внутреннюю сторону крышки или горлышко колбы. Соберите паразитов из колбы и подготовьте их к трансфекции, как описано в текстовом протоколе. Проведите электропорацию таргетирующей плазмиды в штамм toxoplasma delta CO 80.

Перенесите смесь после электропорации в колбу объемом 150 см³, содержащую конфлюэнтные клетки HFF и 30 мл среды для инфицирования. Инкубируйте инфицированную культуру в течение ночи при 37 °C (примерно 20 часов после трансфекции). Замените среду на селекционную среду MPA плюс X.

Теперь оставьте паразитов инкубироваться при 37 °C примерно на восемь дней без перемешивания. Как только появятся бляшки, встряхните колбу, чтобы отделить внеклеточные паразиты от монослоя и получить суспензию паразитов. Перенесите около 0,5 мл суспензии паразитов в новую колбу объемом 25 см с конфлюэнтными клетками HFF, содержащую 5 мл селективной среды MPA plus X.

Примерно через три дня обозначьте данную культуру как PAs one A. Повторите перенос 0.5 mL раствора паразита из исходной колбы в другую колбу с клетками HFF в той же селективной среде. В течение следующих пяти дней обозначьте данную культуру как PAs one B.

Проведите мониторинг первого пассажа A и первого пассажа B для определения pfu. Выберите либо первый пассаж A, либо первый пассаж B для субклонирования, исходя из достаточного количества зон инфекции (более 25). Как только паразиты лизируют клетки HFF, перенесите культуру в новую колбу объемом 25 см с конфлюэнтными клетками HFF, используя селективную среду. Через три недели после трансфекции проведите субклонирование свежевыделенных паразитов, разведя их до соответствующей концентрации в среде MPA plus X, и равномерно распределите раствор паразитов по 96-луночному планшету с конфлюэнтными клетками HFF.

Подготовьте один планшет с концентрацией одного паразита на лунку и второй планшет с концентрацией двух паразитов на лунку. Инкубируйте оба планшета при 37 °C после даты первоначальной трансфекции. Не проводите субклонирование паразитов до 20-го дня для паразитов первого типа или до 25-го дня для паразитов второго типа.

Продолжайте еженедельный пассаж в колбе объемом 25 см, как описано в онлайн-тексте, до тех пор, пока нокаут-штамм не будет валидирован. Примерно через неделю проведите оценку планшетов на 96 лунок при 40–60-кратном увеличении. Отберите только те лунки, которые содержат одну PFU, идентифицированную как единая зона инфекции, используя пипетку, установленную на 50 µL.

Перемешайте содержимое этих лунок, направляя поток жидкости над PFU, чтобы распределить паразитов по всей лунке. Через четыре-пять дней после перемешивания в выбранных лунках отберите дюжину клонов с лизированными клетками. Перенесите 12 клонов из 96-луночного планшета в 12 лунок 24-луночного планшета. Для этого аккуратно проведите наконечником пипетки по дну лунки и наберите 6 µL суспензии.

Перенесите раствор в лунку 24-луночного планшета с конфлюэнтными клетками HFF в 1 мл среды MPA с добавлением селективного агента X. Инкубируйте 24-луночный планшет при 37 °C и контролируйте лизис клеток HFF. Проводите пассаж паразитов из лизированной лунки 24-луночного планшета еженедельно.

Используйте метод посева штрихом для переноса 2 µL раствора паразитов на новую чашку с MPA и селекцией X. После пассажа соберите паразитов из исходного 24-луночного планшета и перенесите их в микропробирки для выделения ДНК.

В завершение используйте ПЦР для анализа делеции целевого гена, чтобы проверить интеграцию пяти-штрих (') и трех-штрих (') целевых флангов, а также для проверки наличия селективного маркера HX GPRT. Данный протокол описывает удаление маркера HX GPRT из модифицированного штамма delta Q 80 и подробно изложен в онлайн-тексте.

P delta GOYC направлен на удаление HX GPRT из паразита путем негативного отбора с использованием шести сред TX. Затем ПЦР применяется для подтверждения потери HX GPRT: в случаях, когда HX GPRT не был удален из локуса, наблюдается полоса размером 1,2 Kilobase pair. При этом присутствует полоса размером 3,4 kilobase pair.

Заключительная часть данного протокола, касающаяся C-концевого мечения белков, также подробно описана в онлайн-тексте; после выполнения изложенного протокола по направленному делетированию гена ПЦР была использована для подтверждения делеции нокаута R 18 типа 1 — локуса, который обычно трудно таргетировать. ПЦР 1 демонстрирует отсутствие продукта амплификации гена R 18.

ПЦР 2 подтверждает наличие 3'-фланга геномного таргетинга R 18; ПЦР 3 и ПЦР 4 подтверждают наличие селективного маркера, правильно интегрированного между 5'- и 3'-флангами геномного таргетинга, что определяет делецию R 18. Чтобы повторно использовать селективный маркер для последующих делеций в штамме, сначала необходимо удалить исходный HX GPRT из локуса. После выполнения описанного протокола.

HX GPRT был удален из делетированного локуса GRA two в штамме delta two 80 delta GRA two HX. Для подтверждения потери HX GPRT использовали G-P-R-T-P-C-R, что проявилось в виде полосы размером 1.2 KILOBASE. В случаях, когда H-X-G-P-R-T не был удален, наблюдалась полоса размером 3.4 kilobase после первоначального этапа таргетного воздействия на ген. Дополнительные методы таргетного воздействия на гены могут быть применены для создания множественных нокаутов в одном и том же штамме типа один или типа два, а также для маркировки или комплементации мутантного штамма с целью ответа на дополнительные вопросы, такие как: где именно в клетке локализуется данный белок?

Или каков основной домен или активность этого белка или пути, которые объясняют его биологическую функцию? Эта методика открывает исследователям в данной области путь к расширению изучения функций генов паразитов в модельном AP-комплексе и у паразита Toxoplasma. Гандхи ай.

Не забывайте, что работа с toxoplasma может быть опасной, поэтому на протяжении всей процедуры необходимо соблюдать меры предосторожности, такие как следование всем правилам уровня биобезопасности BSL-2.