Строительные леса Self-отчетности для 3-Dimensional культуре клеток

Общая цель данного эксперимента заключается в создании pH-чувствительных наносенсоров и самоотчитывающихся каркасов, мониторинг которых в режиме реального времени и in situ позволяет лучше понять условия, влияющие на рост клеток. Для этого сначала подготавливаются биосовместимые аналит-чувствительные наносенсоры, способные отслеживать pH с помощью флуоресцентного сигнала. На втором этапе pH-чувствительные наносенсоры внедряются в полимерные электроспиннинговые каркасы, формирующие трехмерную среду, на которой можно культивировать и мониторировать клетки.

Затем клетки млекопитающих высевают на электропряденые скаффолды, а наносенсоры вводят в их внутриклеточную среду для мониторинга внутриклеточного pH. В ходе экспериментов получены результаты, демонстрирующие способность внутриклеточных наносенсоров и самоотчетных скаффолдов мониторировать pH в условиях тканевой инженерии на основе соотношений флуоресценции, полученных с помощью конфокальной микроскопии. Основным преимуществом данного метода перед существующими способами, такими как использование электронных pH-зондов, является возможность проведения измерений in situ и в режиме реального времени без нарушения клеточного роста.

Для начала подготовьте флуорофоры, растворив 1,5 milligrams fam SE в одном milliliter диметилформамида (DMF) в круглодонной колбе. В другой колбе аналогично растворите 1,5 milligrams Tamara SE в одном milliliter DMF. Затем добавьте в каждую колбу 1,5 milliliters 3-аминопропилтриэтоксисилана и непрерывно перемешивайте в темноте в атмосфере сухого азота при 21 °C в течение 24 часов.

Затем добавьте по 250 µL каждого из двух растворов красителя в смесь, содержащую 6 mL этанола и 4 mL гидроксида аммония, в колбе с круглым дном. Перемешивайте полученную смесь при 21 °C в течение одного часа. Медленно добавьте в смесь 0,5 mL тетраэтилортосиликата и продолжайте перемешивание еще два часа.

В течение этого времени смесь должна стать мутной; затем соберите наносенсоры с помощью роторного испарения и храните их в стеклянном флаконе при температуре four degrees Celsius для дальнейшего использования. Затем добавьте высушенные pH-наносенсоры в концентрации five milligrams per milliliter в фосфатные буферы Соренсона с диапазоном pH от pH 5.5 до pH 7.5 с шагом pH 0.5. Ресуспендируйте наносенсоры, перемешивая образцы на вортексе в течение three minutes, а затем обработайте их ультразвуком в течение five minutes или до тех пор, пока раствор не станет мутным.

Соберите калибровочные данные, измеряя образцы при длине волны возбуждения 488 нанометров для FAM и 568 нанометров для Tamara. Для FAM зарегистрируйте эмиссию в диапазоне от 500 до 530 нанометров, а для Tamara — от 558 до 580 нанометров, и рассчитайте отношение максимумов эмиссии, полученных при каждом значении pH. Затем подготовьте образец для СЭМ-визуализации, поместив образец наносенсоров на держатель (стаб) электронного микроскопа с углеродным покрытием и подвергнув частицы напылению золотом в течение пяти минут в атмосфере аргона.

После нанесения покрытия поместите образцы в электронный микроскоп и отрегулируйте рабочее расстояние, напряжение и увеличение в вытяжном шкафу, чтобы минимизировать зарядку электронами и получить изображения наилучшего качества. Приготовьте 20% раствор PLGA в дихлорметане с добавлением 1% формиата перинеума. Залейте раствор в шприц объемом 10 мл с тупоконечной иглой калибра 18G и надежно закрепите его в шприцевом насосе.

Данный раствор будет использован для изготовления контрольных скаффолдов из PLGA; при этом кончик иглы располагают на расстоянии 20 сантиметров от алюминиевой собирающей пластины размером 20 на 15 сантиметров, электрод источника высокого напряжения подключают к наконечнику шприца, а заземляющий провод — к алюминиевой собирающей пластине. Затем включают источник питания и устанавливают напряжение 12 киловольт. После этого запускают шприцевой насос и подают раствор с постоянной скоростью потока 3,5 миллилитра в час в течение двух часов.

Это обеспечит глубину скаффолда примерно 60 microns. По завершении выключите оборудование и оставьте скаффолд в вытяжном шкафу на 24 hours для испарения остатков растворителя. Для подготовки скаффолдов с включенными pH-чувствительными наносенсорами приготовьте раствор PLGA так же, как описано выше, но на этот раз добавьте также наносенсоры в концентрации 5 mg/mL.

Затем выполните электроспиннинг pH-чувствительного материала, используя те же настройки, что и ранее. Далее откалибруйте pH-чувствительность скаффолда, поместив небольшие образцы высушенного скаффолда с включенными наносенсорами в культуральные чашки диаметром 35 мм и погрузив их в 2 мл фосфатных буферов Соренсена с pH от 5.5 до 7.5 с шагом 0.5, после чего проанализируйте их на конфокальном микроскопе. Для возбуждения FAM используйте аргоновый лазер с длиной волны 488 нм, а для возбуждения Tamara в составе наносенсоров — криптоновый лазер с длиной волны 568 нм.

Наблюдайте за эмиссией в диапазоне от 500 до 530 нанометров для FAM и от 558 до 580 нанометров для Tamara, затем рассчитайте отношение максимумов эмиссии, полученных при каждом значении pH. Сначала стерилизуйте поверхности скаффолдов с помощью источника УФ-излучения с расстояния восемь сантиметров в течение 15 минут с каждой стороны. Затем в стерильных условиях перенесите скаффолды в 12-луночный культуральный планшет и поместите поверх каждого скаффолда стальное кольцо с внутренним диаметром один сантиметр и внешним диаметром два сантиметра.

Затем добавьте PBS с 5% пенициллином-стрептомицином внутрь и снаружи стального кольца и инкубируйте образцы в течение ночи. На следующий день удалите PBS с 5% пенициллином-стрептомицином и промойте скаффолды раствором PBS.

Затем добавьте по 500 µL среды для культивирования клеток внутрь и снаружи стального кольца и предварительно прогрейте планшет в инкубаторе. Далее соберите интересующие клетки и приготовьте клеточную суспензию с концентрацией 1 × 10⁶ клеток/мл. Когда клетки будут готовы, удалите среду из лунки и добавьте 1 мл свежей среды снаружи стального кольца.

Затем добавьте 300 µL клеточной суспензии внутрь стального кольца и осторожно покачайте планшет для равномерного распределения клеток. Поместите планшет в инкубатор при 37 °C с 5% CO2 и инкубируйте клетки в течение необходимого времени. Обновляя среду каждые два-три дня, высевайте клетки на скаффолды, как описано в предыдущем разделе, и дайте им непрерывно расти в течение 72 часов.

Затем промойте клетки PBS и добавьте 500 мкл безсывороточной среды снаружи кольца и 300 мкл внутри кольца. Инкубируйте планшет в течение одного часа при 37 °C. Приготовьте раствор А, добавив 5 мг наносенсоров в 50 мкл Optium и кратковременно перемешав.

Затем приготовьте смесь B, добавив 5 µL lipectomy 2000 к 45 µL Optum, и оставьте смесь инкубироваться при комнатной температуре в течение пяти минут. Далее добавьте раствор A в смесь B и инкубируйте при комнатной температуре в течение 20 минут для получения раствора C, представляющего собой комплекс наносенсорных липосом. Извлеките планшет из инкубатора и внесите 100 µL раствора комплекса внутрь стального кольца.

Затем поместите планшет обратно в инкубатор и инкубируйте клетки с комплексами реагента для липектомии в течение трех часов после инкубации. Аспирируйте среду и дважды промойте клетки подогретым PBS перед погружением каркаса с клетками в буферы с разными значениями pH для мониторинга отклика наносенсоров. Затем проведите визуализацию клеток с помощью флуоресцентной конфокальной микроскопии для отслеживания локализации наносенсоров внутри клеток млекопитающих.

Сначала подготовьте и введите только fam-содержащие наносенсоры в клетки, размещенные на скаффолдах из PLGA. Затем добавьте 2 µL 50 nM LysoTracker Red к 300 µL среды и инкубируйте в течение одного часа при 37 °C по завершении периода инкубации. Удалите среду и дважды промойте клетки PBS.

Затем добавьте либо 2 µL PBS, либо другую среду без фенолового красного, чтобы покрыть клетки во время конфокальной визуализации. Далее добавьте к PBS ядерный краситель Draq5 в концентрации 5 µM и инкубируйте с клетками в течение 3 минут при 37 °C. По истечении 3 минут извлеките планшет из инкубатора и поместите его на столик конфокального микроскопа для получения изображений; визуализируйте кислые органеллы и ядра с помощью наносенсоров, используя различные длины волн возбуждения и эмиссии, как описано в прилагаемом текстовом протоколе, применяя последовательное сканирование во избежание сбора длин волн возбуждения. Распределение по размеру подготовленных pH-чувствительных наносенсоров было охарактеризовано с помощью SEM; при измерении популяции визуализированных наносенсоров было установлено, что их размеры составляют от 240 до 470 nm.

Слева представлено изображение электропряденых волокон PLGA, а справа — электропряденые волокна PLGA с наносенсорами. СЭМ-микрофотографии волокон подтверждают наличие наносенсоров на их поверхности. Кроме того, они могут быть включены в состав самих волокон каркаса.

После электроспиннинга наносенсоры сохраняют свою оптическую и химическую активность; на данном изображении показано их распределение по волокнам каркаса. Слева зеленым цветом отображен краситель FAM, справа красным — краситель TAMRA. Отношение интенсивностей флуоресценции позволяет построить калибровочную кривую, представленную здесь.

Показатели наносенсоров, оцениваемые как отдельно, так и при включении в электроспиннинговые скаффолды из PLGA, были идентичны, что доказывает сохранение оптической активности наносенсоров после их включения в скаффолды. Включенные наносенсоры также демонстрировали выраженный обратимый отклик на изменение значений pH при смене буфера с pH 5,5 на 7,5 и наоборот. Отношение Fam/Tamra каждый раз изменялось предсказуемым образом.

Здесь представлены конфокальные изображения фибробластов, в которые наносенсоры были доставлены внутриклеточно с помощью реагента для трансфекции. Пунктирная колокализация красителей fam и Tamara указывает на то, что красители оставались включенными в матрикс наносенсора. Внутриклеточную доставку наносенсоров можно подтвердить, измеряя соотношение fam/Tamara в клетках, помещенных в различные буферы.

Как здесь видно, соотношение увеличивается при измерении наносенсоров на основе скаффолда, но остается стабильным при измерении сенсоров внутри клеток. После разработки этого метода исследователи в области тканевой инженерии смогут исследовать изменения внутриклеточного pH микроокружения в 3D-клеточных конструктах in situ и в режиме реального времени, не нарушая ход текущего эксперимента.