Строительные леса Self-отчетности для 3-Dimensional культуре клеток

Общая цель данного эксперимента заключается в создании чувствительных к pH наносенсоров и самоотчетных скаффолдов, которые можно контролировать в режиме реального времени и на месте, чтобы помочь в понимании условий, влияющих на рост клеток. Это достигается за счет предварительной подготовки биосовместимых наносенсоров, чувствительных к аналиту, которые могут контролировать pH с помощью флуоресцентных выходов. В качестве второго шага чувствительные к pH наносенсоры встраиваются в полимерные электровращающиеся каркасы, образующие 3D-среду, в которой можно культивировать и контролировать клетки.

Затем клетки млекопитающих размещаются на электровращающихся каркасах, а наносенсоры также доставляются во их внутриклеточную среду для мониторинга внутриклеточного pH. В ходе экспериментов были получены результаты, которые показывают способность внутриклеточных наносенсоров и самосообщающихся скаффолдов контролировать pH в тканеинженерных средах на основе соотношений флуоресценции, полученных с помощью конфокальной микроскопии. Основное преимущество этой методики перед существующими методами, такими как использование электронных pH-зондов, заключается в том, что измерения могут выполняться in situ и в режиме реального времени без необходимости нарушать рост клеток.

Для начала приготовьте флуорофоры, растворив 1,5 миллиграмма fam SE в одном миллилитре диметилформамида, известного как DMF, в круглом дне. Колба также растворяет 1,5 миллиграмма Tamara SE в одном миллилитре DMF во второй колбе. Затем добавьте по 1,5 миллилитров трех аминопропилтриэтила в каждую колбу и непрерывно помешивайте в темноте в атмосфере сухого азота при температуре 21 градус Цельсия в течение 24 часов.

Далее добавьте 250 микролитров обоих растворов красителя в смесь, содержащую шесть миллилитров этанола и четыре миллилитра гидроксида аммония, содержащихся в круглой донной колбе. Перемешайте эту новую смесь при температуре 21 градус Цельсия через час. Медленно добавьте в смесь 0,5 миллилитра силиката тетраэтилортоса, и продолжайте помешивать еще два часа.

В течение этого времени ожидайте, что смесь помутнеет, затем соберите наносенсоры путем ротационного испарения и храните их в стеклянном флаконе при температуре четыре градуса Цельсия для дальнейшего использования. Затем добавьте высушенные наносенсоры pH в концентрации пять миллиграммов на миллилитр в фосфатные буферы Соренсона, в диапазоне pH 5,5 до pH 7,5 с шагом pH 0,5. Восстановите суспендию наносенсоров, воздействуя на образцы в течение трех минут, а затем обрабатывайте их ультразвуком в течение пяти минут или до тех пор, пока раствор не станет мутным.

Сбор данных калибровки путем измерения образцов на длине волны возбуждения 488 нанометров для FAM и 568 нанометров. Для Tamara соберите данные о выбросах в диапазоне от 500 до 530 нанометров для FAM и от 558 до 580 нанометров для Tamara, а также рассчитайте отношение максимумов излучения, полученных при каждом значении pH. Затем подготовьте образец для СЭМ-визуализации, поместив образец наносенсоров на электронный микроскоп с углеродным покрытием, отрубите и распылите покрытие частиц золотом в течение пяти минут под атмосферой аргона.

После нанесения покрытия поместите образцы в электронный микроскоп и отрегулируйте рабочее расстояние, напряжение и увеличение, чтобы свести к минимуму заряд электронов и получить наилучшие изображения в вытяжном шкафу. Приготовьте 20%-ный раствор PLGA в дихлорметане с 1%-ным формиатом промежности. Загрузите раствор в шприц объемом 10 миллилитров с тупой иглой для заполнения 18 калибра и надежно закрепите его на шприцевом насосе.

Это решение будет использовано для того, чтобы управление PLGA скаффолдов отдалило наконечник иглы на 20 сантиметров от алюминиевой сборной пластины размером 20 на 15 сантиметров, а электрод высоковольтного источника питания был прикреплен к наконечнику шприца и заземлен проводом к алюминиевой сборной пластине. Далее включите блок питания и отрегулируйте напряжение на 12 киловольт. Затем включите шприцевой насос и подавайте раствор с помощью постоянной скорости потока 3,5 миллилитра в час в течение двух часов.

Это позволит получить глубину каркаса примерно 60 микрон. После этого выключите оборудование и оставьте каркас в вытяжном шкафу на 24 часа, чтобы остатки растворителя испарились. Чтобы получить каркасы, интегрированные с pH-чувствительными наносенсорами, приготовьте раствор PLGA так же, как и раньше, но на этот раз также добавьте пять миллиграммов на миллилитр наносенсоров.

Затем электроспин регулирует pH, используя те же настройки, что и раньше. Затем откалибруйте реакцию скаффолда на рН, поместив небольшие образцы высушенного каркаса со встроенными наносенсорами в 35-миллиметровые культуральные планшеты и погрузив их в два миллилитра буферов соренсенфосфата при pH от 5,5 до 7,5 с шагом 0,5 на конфокальный микроскоп. Используйте аргоновый лазер 488 нанометров для возбуждения FAM и криптоновый лазер 568 нанометров для возбуждения Тамары в наносенсорах.

Наблюдайте за излучением на частотах от 500 до 530 нанометров для FAM и от 558 до 580 нанометров для Tamara, а затем рассчитайте соотношение максимумов излучения, полученных при каждом значении pH. Сначала простерилизуйте поверхности лесов источником ультрафиолетового света на расстоянии восьми сантиметров в течение 15 минут с каждой стороны. Затем стерильно перенесите скаффолды на 12-луночную культуральную плиту и поместите поверх скаффолда стальное кольцо с внутренним диаметром один сантиметр и внешним диаметром два сантиметра.

Затем добавьте PBS с 5%-ной полосой ручки внутрь и снаружи стального кольца и инкубируйте образцы на ночь. На следующий день. Снимите PBS с помощью 5% стрептококка и промойте леса PBS.

Затем добавьте 500 микролитров среды для клеточных культур внутрь и снаружи стального кольца и предварительно прогрейте пластину в инкубаторе. Затем соберите интересующие клетки и приготовьте клеточную суспензию из расчета один умножить на 10 до шести клеток на миллилитр. Когда ячейки будут готовы, извлеките среду из лунки и добавьте один миллилитр свежей среды на внешнюю сторону стального кольца.

Затем добавьте 300 микролитров клеточной суспензии внутрь стального кольца и аккуратно покачивайте пластину, чтобы равномерно распределить клетки. Поместите планшет в инкубатор с температурой 37 градусов Цельсия и 5% CO2 и инкубируйте клетки столько, сколько потребуется. Обновляйте среду каждые два-три дня, засеивайте клетки на каркасах, как описано в предыдущем разделе, и дайте им непрерывно расти в течение 72 часов.

Затем промойте клетки PBS и добавьте 500 микролитров бессывороточной среды на внешнюю сторону кольца и 300 микролитров внутрь кольца. Инкубируйте планшет в течение одного часа при температуре 37 градусов Цельсия во время инкубации. Приготовьте раствор А, добавив пять миллиграммов наносенсоров с 50 микролитрами оптимального и кратковременно прелюбодейскими.

Затем смешивают раствор В, добавив пять микролитров липэктомии 2000 к 45 микролитрам Оптума, и дают смеси инкубироваться при комнатной температуре в течение пяти минут. Затем добавьте раствор А в раствор В, смешайте и затем инкубируйте при комнатной температуре в течение 20 минут до получения раствора С, который представляет собой комплекс наносенсорных липосом. Достаньте пластину из инкубатора и добавьте 100 микролитров комплексного раствора внутрь стального кольца.

Затем поместите планшет обратно в инкубатор и инкубируйте клетки с комплексами липэктомических реагентов в течение трех часов после инкубации. Аспирируйте среду и дважды промойте клетки подогретым PBS, прежде чем погрузить каркас в ячейке в буферы с различными ph для мониторинга отклика наносенсоров. Теперь внутри клеток визуализируйте клетки с помощью флуоресцентной конфокальной микроскопии, чтобы отследить расположение наносенсоров в клетках млекопитающих.

Во-первых, подготовить и доставить только фам, содержащие наносенсоры, в клетки, расположенные на каркасах PLGA. Затем добавьте два микролитра 50 наномолярного лиотрекера красного цвета в 300 микролитров среды и инкубируйте в течение одного часа при температуре 37 градусов Цельсия после периода инкубации. Извлеките носитель и дважды промойте ячейки PBS.

Затем добавьте два микролитра PBS или другой феноловой красной среды, чтобы покрыть клетки во время конфокальной визуализации. Далее добавьте пять микромоляров ядерного красителя, добавьте пять микромоляров в PBS и инкубируйте с клетками в течение трех минут при температуре 37 градусов Цельсия. Через три минуты извлеките планшет из инкубатора и поместите его на конфокальный столик для визуализации изображения, наносенсоры, кислотные органеллы и ядра, используя различные длины волн возбуждения и излучения, как описано в сопроводительном текстовом протоколе, при этом используя последовательное сканирование для избежания сбора длин волн возбуждения, распределение по размерам подготовленных pH-чувствительных наносенсоров было охарактеризовано с помощью СЭМ, где популяция наносенсоров, изображенных на изображениях, была измерена и установлено, что имеют нанометровые размеры в диапазоне от 240 до 470 нанометров.

Слева показано изображение волокон PLGA с помощью электроса, а справа — волокон PLGA с наносенсорами. Микрофотографии волокон на СЭМ свидетельствуют о наличии наносенсорных ассоциаций на поверхности волокон. Тем не менее, они также могут быть включены в волокна каркаса.

После вращения электродатчиков наносенсоры сохраняют свою способность оставаться оптически и химически активными и показаны здесь в связи с волокнами каркаса. Слева краситель fam показан зеленым цветом, а справа краситель Tamara показан красным. Отношение интенсивности флуоресценции позволяет получить калибровочную кривую, как показано ниже.

Наносенсоры, оцененные по отдельности и при встраивании в электровращающиеся каркасы PLGA, зеркально отражали друг друга, демонстрируя, что наносенсоры сохраняют свою оптическую активность после встраивания в каркасы. Встроенные наносенсоры также обратимо реагируют на изменение значений pH, поскольку буфер чередовался между pH от 5,5 до 7,5. Коэффициент fam Tamra предсказуемо реагировал каждый раз, когда показывался.

Вот конфокальные изображения фибробластов, наносенсоры которых доставлялись внутриклеточно с помощью трансфекционного реагента. Точечная колокализация красителей fam и Tamara позволяет предположить, что красители остались в ловушке в наносенсорной матрице. Внутриклеточная доставка наносенсоров может быть подтверждена путем измерения соотношения fam Tamara клеток, помещенных в различные буферы.

Как вы можете видеть, это соотношение увеличивается при измерении наносенсоров на основе скаффолда, но остается неизменным при измерении датчиков внутри клеток. После разработки этого метода исследователи в области тканевой инженерии могут проводить исследования in situ и в режиме реального времени. Микроэкологические внутриклеточные изменения pH в трехмерных клеточных конструкциях без нарушения текущего эксперимента.