Печать Thermoresponsive Пресс-формы для обратной Создание образца двухкомпонентной 3D гидрогелей для клеточных культур

Общая цель этой процедуры заключается в печати обратной формы для создания двухкомпонентных гидрогелей с рисунком для 3D-культуры клеток. Это достигается путем первичной печати обратной формы из термореверсивного полимера, который представляет собой жидкость при температуре четыре градуса Цельсия, но мягкий гель при комнатной температуре. В дальнейшем эту обратную форму можно ускользнуть.

Вторым шагом является заполнение обратной формы биополимером по выбору. Здесь мы использовали aros. Биополимер может быть сшит с помощью ферментативного, ультрафиолетового или температурного сшивания.

Затем на обратную форму намекают путем погружения формы в холодную воду. После этого шага полученная форма AROS готова к дальнейшей обработке. Последним шагом является заполнение пустот вторым биополимером, который может содержать клетки и может быть сшит с помощью ферментов, ультрафиолетового излучения или температуры.

В конечном счете, мы разработали воспроизводимый метод создания пространственно организованных в D клеточных культур каркасов. Впервые идея этого метода пришла нам в голову, когда коллега предложил нам воспользоваться термочувствительными свойствами Oxr, используя его в качестве формы для жертвоприношений. Демонстрировать процедуру будет Миша Муах, аспирант моей лаборатории.

Для начала добавьте в стеклянную бутылку 60 миллилитров ледяного раствора PBS и энергично перемешайте с помощью магнитной мешалки. Затем отвесьте 24,5 грамма Paul ER и добавьте его в небольших количествах в холодную PBS. Подождите, пока Paul Oxr частично растворится в PBS, прежде чем добавлять новые.

Продолжайте помешивать раствор до тех пор, пока весь Paul Oxr не растворится. Затем добавьте дополнительно ледяной PBS до тех пор, пока не будет достигнут окончательный объем в 100 миллилитров, в результате чего конечная концентрация составит 24,5% веса на объем. Затем перемешайте смесь до тех пор, пока она хорошо не перемешается.

Прекратите помешивать раствор и дайте ему отдохнуть при температуре четыре градуса Цельсия на ночь, пока пузырьки и пена в растворе не исчезнут. Пузырьки, попавшие в ловушку геля, переносятся на картридж принтера и приводят к дефектам напечатанных форм для жертв. Стерильный Отфильтруйте раствор непосредственно в картридже с помощью фильтра предварительного охлаждения, чтобы удалить любые нежелательные частицы, которые могут засорить иглу.

Храните картридж при температуре четыре градуса Цельсия до 30 минут до начала эксперимента. Подготовьте электромагнитный клапан и иглу к печати, поместив их в отдельные микроцентрифужные пробирки объемом 1,5 миллилитров, наполненные сверхчистой водой, и синдицируйте их в течение 30 минут. Затем очищенные клапаны промойте этанолом и просушите их азотным пистолетом.

Далее установите чистый электромагнитный клапан и иглу в принтер. Кроме того, установите пустой чистый картридж для проверки системы. Подайте давление в три бара на систему и выдуйте остатки жидкости из установленного клапана и иглы сжатым воздухом.

Для игл малого диаметра. Установите фильтр на выходе сжатого воздуха, чтобы избежать попадания мелких частиц, которые могут закупорить иглу. Затем выключите давление.

Когда давление упадет до нуля, установите картридж с предварительно нагруженным полиоксом. Картридж следует достать из холодильника примерно за 30 минут до установки картриджа, чтобы еще жидкий полиокср мог достичь комнатной температуры и стать гелеобразным перед печатью. Проверьте, не желеет ли полиокср, перевернув картридж.

Затем приложите к системе давление в три бара и дозируйте Paul Emer, пока он не достигнет кончика иглы и не будет выдавлен непрерывной нитью. Используя программное обеспечение bio CAD, нарисуйте одну линию примерно той же длины, что и структура, которую вы собираетесь напечатать, в меню настроек программного обеспечения принтера. Установите электромагнитный клапан на высокую частоту 50 Гц в разделе параметров и вручную настройте настройку высокого давления на три бара.

Далее установите стеклянный микроскоп, вставьте принтер и закрепите его на месте, включив пылесос. Затем напечатайте один слой одной линии со скоростью сцены 300 миллиметров в минуту. Получите желаемую ширину линии за счет снижения давления вручную и настроек частоты в программном обеспечении для каждой новой линии, следите за тем, чтобы линия оставалась непрерывной.

Если нарисованная линия нарушена, то достигнут нижний предел. После того, как будет получена непрерывная линия желаемой ширины, определите оптимальную скорость этапа и толщину слоя, проверив наличие дефектов в напечатанных конструкциях. Для точной настройки толщины слоя также может потребоваться небольшая регулировка давления и частоты.

Чтобы проверить настройку толщины слоя, напечатайте несколько слоев друг на друге и следите за тем, чтобы игла находилась в правильном положении над предыдущим слоем. Отрегулируйте толщину слоя так, чтобы каждый слой печатался непосредственно поверх предыдущего. Чтобы оптимизировать скорость столика, начните с постепенного уменьшения скорости столика с 300 миллиметров в минуту так, чтобы экструдированные слои начинались и заканчивались в тех же положениях, что и предыдущие.

Если сцена движется слишком быстро, в верхней части слоя появится волнообразный узор. Для печати столбчатых конструкций нарисуйте одну точку, а не линию в программном обеспечении CAD. Затем отрегулируйте давление и частоту, чтобы отрегулировать толщину слоя и диаметр стойки, а также время шага печатающей головки, чтобы максимизировать скорость печати.

После оптимизации сохраните параметры для дальнейшего использования. Сначала напечатайте внутреннюю структуру, такую как эта массив столбов, на предметном стекле для микроскопа и дайте ей высохнуть. Ночное высыхание уменьшает размер и толщину конструкций и обеспечивает лучшую адгезию между структурой и основанием.

На следующий день нарисуйте структуру, состоящую из внешней стены, окружающей структуры, которые вы собираетесь ускользнуть и заполнить. Полимерная стенка должна быть напечатана на расстоянии не менее 3,5 миллиметров от внутренних структур из-за габаритов иглы. Затем приготовьте смесь из 1% ароса в деионизированной воде, нагрев ее в микроволновой печи после полного растворения.

Охладите агрораствор до 35-45 градусов по Цельсию. Затем заполните жертвенную форму агрораствором с помощью пипетки. Делать это нужно медленно, чтобы избежать разрушения конструкции внутри стены.

После заполнения поместите форму при температуре четыре градуса Цельсия, чтобы гель затвердел. Примерно через 10 минут достаньте гель из холодильника и поместите его в ледяную баню на 10 минут, чтобы полимерная структура вымылась. Затем аккуратно снимите конструкцию и удалите остатки воды, промокнув ее бумажной салфеткой.

Осторожно надавите на новое предметное стекло микроскопа, чтобы создать хорошее уплотнение, предотвращающее утечку третьего гидрогеля. Далее приготовьте 1%-ный раствор альгината метакрилата в 0,15 моляра натрия хлорида. Вихревым раствором раствор растворить альгинат метакрилата.

Затем добавьте 2,5% объема к объему. Alexa, 4 88 конъюгированный фибриноген и 0,05% массы на объем. Фенил лития 2 4 6 триметилбензоилфосфат для получения третьего гидрогеля, который можно легко визуализировать с помощью флуоресценции.

Поместите этот раствор в шприц объемом 0,3 миллилитра, оснащенный иглой 30 калибра. Затем с помощью шприца заполните пустоты, оставленные ускользающим полимером. Обязательно полностью заполните каждую колонку, выбрасывая полимер по мере того, как игла вытягивается из каждой колонки.

Наконец, фотополимеризуйте инъецированный полимер с помощью ультрафиолетовой лампы высокой интенсивности в течение пяти минут, а затем визуализируйте конструкцию с помощью эпифлуоресцентного или конфокального микроскопа. Здесь показана 3D-реконструкция Заком конструкции, похожей на ту, которая была только что изготовлена, с флуоресцентной маркировкой альгината, используемого для засыпки. Формы колонн отображаются в виде зеленых колонн, а внешняя часть конструкции прозрачна.

Методы, показанные в этом видео, широко адаптируются ко многим различным 3D-схемам, таким как концентрические круги, показанные здесь. Разрешающая способность зависит от диаметра иглы. Игла диаметром 150 микрон, используемая для этой конструкции, может производить нити диаметром от 120 до 200 микрон.

После просмотра этого видео вы должны иметь хорошее представление об этапах, связанных с печатью oxr. Мы продемонстрировали использование окср в качестве жертвенной формы для создания узорчатых гидрогелей, но окср также может быть стабилизирован ультрафиолетом, если используется версия полимера, связанная с производством.