Культивирование Микроглии от новорожденных и взрослых центральной нервной системы

Общая цель этой процедуры заключается в выделении первичных клеток микроглии из коры головного мозга новорожденной мыши или спинного мозга взрослой мыши. Это достигается путем удаления мозга мышиного щенка на нулевой или второй день после рождения или взрослого спинного мозга. Затем либо кора головного мозга собирается из неонатальной ткани, либо переваривается ткань спинного мозга.

Затем клетки коры головного мозга и спинномозговой ткани культивируются до экспериментального использования. В конечном счете, собранные неонатальные и взрослые микроглиальные клетки могут быть проанализированы с помощью иммунофлуоресцентной микроскопии. Основное преимущество нашего протокола культивирования микроглии у новорожденных по сравнению с существующими методами, такими как встряхивание клеток микроглии для смешанных кортикальных пластинок, заключается в том, что клетки легко возвращаются в состояние покоя и могут обеспечить более точную картину поведения микроглиальных клеток in vivo.

Основное преимущество бактериологического исследования микроглии из спинного мозга взрослого человека заключается в том, что клетки могут быть процитированы в контексте патологий, которые в основном поражают центральную нервную систему взрослого человека до вскрытия. 10-сантиметровые чашки для культивирования тканей Preco с пятью микрограммами на миллилитр поли-делицина или PDL, разведенными в воде автоклава Через три часа при температуре 37 градусов Цельсия аспирируйте PDL и промойте пластины водой из автоклава непосредственно перед началом неонатальной микроглии. Высушите пластины под ультрафиолетовым светом в вытяжке для тканевых культур в течение 20 минут.

Затем используйте салфетку Кима, смоченную в 70% этаноле, чтобы продезинфицировать головы обезболенных щенков после того, как они удалили головы ножницами. Поместите по четыре головки на тарелку в 10-сантиметровые чашки Петри, содержащие ледяные пучки буферного солевого раствора. С помощью изогнутых щипцов закрепите головки через глазницы, а затем с помощью прямых микрощипцов аккуратно удалите кожу, покрывающую череп.

Затем, начиная с мозжечка, удалите кости черепа, стараясь не проколоть и не повредить кору головного мозга. С помощью небольшого шпателя удалите мозги, объединив органы в свежую чашку Петри, содержащую ледяной HBSS. Теперь начинаем с вентральной стороны мозга.

Удерживайте мозжечок микрощипцами, чтобы закрепить ткань, а затем сделайте два небольших разреза с каждой стороны среднего мозга, не разрезая ткань полностью. Аккуратно подразните средний мозг и мозжечок одним кусочком от коры, которая должна образовать вогнутую форму. Затем отделите изолированные коры головного мозга и ориентируйте единую кору медиальной стороной вверх для дальнейшего вскрытия.

Как в неонатальном, так и во взрослом протоколах одним из самых сложных этапов является адекватное удаление мозговых оболочек. Также трудно удалить гиппокамп. В неонатальном протоколе мы используем ледяной буферный раствор Ганкса для придания жесткости тканям, а также используем медленную методичную процедуру рассечения для минимизации измельчения.

Удалите серповидный гиппокамп, расположенный напротив обонятельной луковицы, который выглядит в виде небольшого узелка на заостренном конце коры. Затем переверните кору, чтобы увидеть дорсальную сторону. Далее, используя обонятельную луковицу в качестве отправной точки, удалите все мозговые оболочки и саму обонятельную луковицу из коры головного мозга.

Затем втяните рассеченные коры головного мозга в 15-миллилитровую коническую трубку, содержащую 14 миллилитров ледяного HBSS на льду. Теперь отсадите HBSS из Cordis и используйте наконечник пипетки P 1000 для тритации коры головного мозга несколько раз. Добавьте в ткани четыре миллилитра трипсина ЭДТА, а затем инкубируйте ткани при температуре 37 градусов Цельсия.

Через 15 минут остановите ферментативную реакцию с четырьмя миллилитрами полной микроглиальной среды, а затем раскрутите клеточные суспензии в течение пяти минут при 1000-кратном G и комнатной температуре. После второй промывки четырьмя миллилитрами полной среды суспензируйте клеточную гранулу в 10 миллилитрах полной микроглиальной среды, а затем отфильтруйте клеточную суспензию через сетчатое сетчатое сетчатое фильтр 40 микрон. Наконец, поместите клетки с плотностью восемь коры на 10 миллилитров микроглиальной среды в одну из 10-сантиметровых тканевых культуральных планшетов, покрытых PD L, и инкубируйте клетки при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа.

После 10 дней культивирования клеток отделите микроглию, добавив 400 микролитров 60 миллимолярного лидокаина в HBSS в планшет для культуры тканей, и инкубируйте планшет при комнатной температуре в течение 10-15 минут. Затем соберите ресуспензированные клетки. Ополосните пластину один раз с помощью HBSS и соберите смывку, чтобы восстановить остатки микроглии.

Затем добавьте 0,5 моляра ЭДТА в клеточную суспензию до конечной концентрации в пять миллимоляров, а затем понизьте ресс клеток. Суспендируйте небо в одном миллилитре DMEM с 1% FBS и определите количество жизнеспособных клеток путем исключения трианового синего. Затем культивируйте клетки с желаемой экспериментальной плотностью.

Например, для анализа с помощью иммунофлуоресцентной микроскопической пластины клетки в соотношении 2,5 умножить на 10 до четвертой клетки на 18 миллиметровый покровный листок для сбора тканей микроглии у взрослого человека. Начните с использования 70% этанола для очистки позвоночника усыпленной взрослой мыши. Затем с помощью ножниц разрежьте кожу над спинным мозгом и продолжайте вырезать спинной мозг от области T 1 до T 12.

Отрежьте оставшуюся мышцу по бокам спинного мозга, а затем аккуратно придерживая спинной мозг кончиками пальцев одной руки. Используйте микроножницы, чтобы медленно разрезать позвонки, не прокалывая спинной мозг. Затем с помощью пары микрощипцов медленно извлеките спинной мозг, погрузите мозг в чашку Петри, содержащую ледяной HBSS, а затем удалите все видимые мозговые оболочки под микроскопом.

Теперь разрежьте спинной мозг на поперечные сегменты, не толще двух миллиметров, чтобы облегчить эффективное пищеварение, а затем перенесите фрагменты в коническую трубку объемом 15 миллилитров, содержащую один миллилитр охлажденного льдом HBSS на льду. Чтобы переварить фрагменты ткани спинного мозга, начните с аспирации HBS из ткани спинного мозга, стараясь не повредить ткань. Затем инкубируйте ткань в одном миллилитре трипсина при температуре 37 градусов Цельсия.

Через 30 минут удалите трипсин и добавьте три миллилитра первичной микроглиевой среды, содержащей сыворотку, чтобы остановить ферментативное переваривание. После нескольких пипетирования вверх и вниз для вытеснения ткани отфильтруйте клеточную суспензию через клеточный фильтр 40 микрон. Затем смешайте аликвоту клеточной суспензии с равным объемом DPI и подсчитайте клетки под флуоресцентным микроскопом, чтобы определить общее жизнеспособное количество клеток.

Наконец, диссоциированные клетки ткани спинного мозга в пластинах, покрытых PD L, имеют соответствующую экспериментальную плотность. Выполните полную замену среды через четыре часа после нанесения покрытия, чтобы удалить излишки клеточных остатков. На этом первом наборе изображений покоящиеся и активированные клетки микроглии показаны через 24 часа после покрытия микроглии, разветвленной или ржавеющей морфологии бактериального липополисахарида приводит к изменениям морфологии микроглии до более амебоидной формы по мере активации клеток.

Глазное яблоко, окрашивающее маркер, специфичный для макрофагов и белка поверхности клеток микроглии и появляющийся зеленым цветом, облегчает визуализацию клеток. На светлом изображении показаны общие популяции клеток, а DPI, выделенный синим цветом, выделяет ядра и указывает на чистоту культуры. На этом репрезентативном изображении клеток, выделенных из спинного мозга взрослой мыши, было получено примерно в семь раз от 10 до пятой жизнеспособных клеток.

Настройки светлопольного и флуоресцентного микроскопа были объединены для визуализации DAPI-положительных клеток, а также сетки гемоцитометра для точного подсчета клеток. Микроглия полностью прикрепляется к культуральным планшетам, покрытым PD L, примерно через два дня. В приведенной здесь культуре микроглия, выделенная из спинного мозга зеленых мышей Mac, которая экспрессирует GFP под контролем микроглии и промотора макрофагов CSF one R, показана на светлопольном изображении.

Микроглии, как указано синими стрелками, и астроциты, как указано красными стрелками, можно наблюдать после освоения. Эту технику можно выполнить примерно за час после этой процедуры. Другие методы, такие как аккультурация, микроглия с другими типами клеток, могут быть выполнены для того, чтобы изучить эффект, который микроглия оказывает на другие клетки.

После этой процедуры вы должны хорошо понимать, как выполнять деликатную диссекцию, необходимую для культивирования неокортикальных и взрослых клеток спинного мозга, и использовать эти клетки в последующих приложениях.