Разделение сперматогенного Типы клеток с использованием STA-PUT скорости осаждения

Общая цель этой процедуры состоит в том, чтобы разделить различные типы клеток, обнаруженных в яичках. Во-первых, соберите смешанную популяцию клеток у мыши. Яички нагружают элементы и градиент BSA в стационарный аппарат.

Теперь позвольте клеткам оседать через градиент BSA. Затем соберите дроби и объедините их исходя из клеточного состава. В конечном счете, скоростное осаждение с удержанием используется для отделения различных типов клеток от яичек на основе различий в размере и плотности.

Основное преимущество этого метода перед существующими методами заключается в том, что можно выделить большое количество различных типов клеток с довольно высокой чистотой с помощью простой стеклянной посуды и силы тяжести. Закрепите двухлитровые баллоны и загрузочную камеру ячеек на верхней платформе и соедините все двумя небольшими трубками с трубочными зажимами. Зажмите все трубки и запечатайте носик на крайнем правом двухлитровом цилиндре.

Поместите маленькую мешалку в камеру загрузки ячеек, а большую мешалку — в крайний левый двухлитровый цилиндр. Затем поместите двухлитровую отстойную камеру на платформу. Расположите металлическую перегородку непосредственно над отверстием в нижней части отстойной камеры, чтобы предотвратить завихрение жидкости и нарушение градиента ячеек во время сбора фракции.

Теперь ставим крышку на отстойную камеру. Нанесите очень небольшое количество вакуумной смазки на шлифованное стеклянное соединение трехстороннего стопорного крана. Затем прижмите запорный кран ко дну осадочной камеры, соединив шлифостеклянные стыки запорного крана и осадочной камеры.

Далее подсоедините камеру загрузки ячеек к правому выходу запорного крана с трубкой. Закройте запорный кран, затем прикрепите трубку для фракционирования клеток к левому выходу запорного крана и зажмите маленькую трубку в самом низу. Налейте 2%-ный раствор БСА в левый двухлитровый цилиндр.

Налейте 4% раствор БСА в правый двухлитровый цилиндр. Убедитесь, что в трубке, соединяющей эти цилиндры, нет крупных пузырей. Залейте буфер Кребса в камеру загрузки ячеек и заполните трубку, соединяющую эту камеру с камерой отстаивания.

Убедитесь, что нет больших пузырьков, которые могут нарушить градиент. При необходимости осторожно сожмите или переверните трубку, чтобы удалить пузырьки. Убедитесь, что все кребсы находятся в пробирке, а не в камере клетки.

Дайте небольшому количеству буфера Кребса стечь в осадочную камеру. Затем слейте почти весь буфер в трубку фракционирования клеток. Чтобы заполнить трубку и удалить крупные пузырьки, поместите сборник фракций непосредственно под камерой осаждения.

Убедитесь, что все пробирки с фракциями на месте, и накройте полиэтиленовой пленкой во избежание загрязнения. Декапсулируйте семенники в отдельную пластину, содержащую восемь миллилитров Кребса. Сделайте надрез на тонкой мембране, которая окружает семенные канальцы, с помощью одной пары щипцов.

Теперь удерживайте мембрану еще одной парой щипцов. Вытолкните трубочки из мембраны и в сторону от нее. Перенесите четыре миллилитра Кребса, содержащего канальцы, в каждую коническую трубку, содержащую 25 миллилитров раствора коллагеназы.

Встряхивайте при температуре 33 градуса Цельсия в течение 10 минут, пока канальцы не приобретут вид, похожий на спагетти. Далее дайте трубочкам отстояться в течение пяти минут до дна трубки. Вылейте надосадочную жидкость и дважды промойте 25 миллилитрами Krebs комнатной температуры, каждый раз позволяя трубочкам осесть на дно трубки.

Оставьте примерно по пять миллилитров Кребса в каждой тюбике. После инкубации канальцев с трипсином. Используйте пипетку с широким отверстием для перемешивания раствора, содержащего канальцы.

Дозируйте их внутрь и наружу примерно 10 раз. Раствор должен начать больше походить на одноклеточную суспензию. Теперь отфильтруйте каждую 30 миллилитровую суспензию одиночных клеток через сетчатое сетчатое сетчатое сетчатое фильтр

После объединения клеточных суспензий подсчитайте общее количество клеток. Убедитесь, что запорный кран расположен таким образом, чтобы направлять поток из камеры камеры в камеру отстойника. Переверните обе пластины для перемешивания на низкий уровень.

Затем залить клеточную суспензию в камеру клетки. Откройте запорный кран, чтобы клетки медленно поступали в отстойную камеру со скоростью 10 миллилитров в минуту. Затем закройте запорный кран, чтобы вымыть клетки из камеры камеры.

Налейте пять миллилитров 0,5%-ного раствора БСА и слейте в отстойную камеру со скоростью 10 миллилитров в минуту. Закройте запорный кран и повторите промывку BSA еще четыре раза. Теперь откройте зажимы между камерой ячейки и двумя двухлитровыми цилиндрами, чтобы немедленно слить жидкость в отстойную камеру со скоростью 40 миллилитров в минуту, отрегулируйте скорость потока так, чтобы загрузка градиента BSA в осадочную камеру занимала примерно от 20 до 30 минут.

Следите за тонким ненарушенным слоем клеток, лежащим поверх градиента BSA. После того, как большая часть BSA будет загружена, закройте запорный кран и поверните его в положение, которое позволит жидкости стекать из осадочной камеры в трубку фракционирования. Теперь выключите пластины для перемешивания и дайте ячейкам отстояться в течение одного часа 45 минут.

После завершения осаждения присоедините трубку для фракции к сборнику фракций. Отрегулируйте скорость потока с помощью запорного крана так, чтобы каждые 45 секунд собиралось 10 миллилитров на сборную пробирку. После того, как все фракции собраны, микроскопически проанализируйте фракции для различных клеточных популяций.

Различные типы клеток могут быть выделены на основе размера клеток и морфологии ядра, чтобы определить чистоту каждой фракции. Перенесите 10 микролитров клеток, окрашенных DPI, на предметное стекло. Установите покровную крышку и проанализируйте с помощью флуоресцентного микроскопа.

Извлекайте фракции, похожие по размеру и морфологии ядра, чтобы создать популяции клеток. Типичная подготовка примерно из 22 семенников. При такой процедуре пребывания на месте получается примерно от 10 до восьмой клетки.

Фракции метагенных типов клеток Perper могут быть быстро проанализированы с помощью комбинации световой и флуоресцентной микроскопии. Миотические, сперматогониевые и соматические диплоидные клетки являются самыми крупными клетками, обнаруженными в яичках, и содержат большие ядра, которые окрашиваются относительно однородно с точки зрения DPI. Круглые сперматиды — это более мелкие клетки с меньшими круглыми ядрами, как правило, с ярко окрашивающимся хромоцентром, удлиненные сперматиды — это небольшие клетки, которые имеют серповидные ядра.

После объединения клеточных фракций чистота может быть дополнительно определена с помощью западного анализа крови на клеточные лизаты. Общими маркерами миотических клеток являются белки Synap Neal Complex one. Общими маркерами конденсирующихся сперматид являются переходные белки или протамин.

После освоения этой техники ее можно выполнить за семь часов, если она будет выполнена должным образом после ее освоения. Этот метод проложил путь исследователям в области сперматогенеза к изучению клеточных процессов в различных типах клеток от яичек.