Отслойки Модель в Грызуны по субретинальной инжекции гиалуронат натрия
11 сентября 2013 г.
Создание экспериментальных сетчатки отряды с воспроизводимым и устойчивой высоте отряда, и без субретинальной кровоизлияния, имеет важное значение для изучения патофизиологии потери фоторецепторов клеток в заболевания сетчатки и оценки потенциальных терапевтических вмешательств. Здесь мы сообщаем такой метод в деталях.
Общая цель данной процедуры заключается в создании экспериментальной отслойки сетчатки с воспроизводимой и стабильной высотой отслойки без возникновения субретинального кровоизлияния. Для этого сначала делают разрез временной конъюнктивы у заднего края лимба, чтобы отделить конъюнктиву от склеры. На втором этапе с помощью кончика иглы 30G выполняется самогерметизирующаяся склеральная инъекция и прокол роговицы.
Затем в субретинальное пространство вводится уринат натрия, чтобы отслоить нейросенсорную сетчатку от подлежащего ретинального пигментного эпителия. На заключительном этапе на рану склеры наносится цианоакрилатный клей, и конъюнктива возвращается в исходное положение, что снижает риск утечки урината натрия. В завершение проводится исследование глазного дна с использованием покровного стекла для подтверждения создания локальной отслойки сетчатки без субретинального кровоизлияния.
Существующие методы отслойки сетчатки у грызунов могут приводить к вариабельности высоты и устойчивости отслойки, что вызывает нестабильные показатели уровня гибели клеток. Благодаря данной методике можно создать воспроизводимую буллезную и стойкую отслойку сетчатки с пониженным риском возникновения субретинальных геморрагий, что позволяет получить надежную модель отслойки сетчатки у грызунов. Экспериментальная отслойка сетчатки у грызунов относительно проста в исполнении, имеет приемлемую временную динамику и весьма схожа с течением данного заболевания у людей.
Таким образом, это отличная модель для изучения механизмов гибели фоторецепторных клеток и методов терапии по предотвращению потери зрения. При регенеративных заболеваниях сетчатки, характеризующихся гибелью фоторецепторов при отслойке сетчатки, целесообразно создавать воспроизводимую отслойку без субретинального кровоизлияния. Это обусловлено тем, что увеличение продолжительности отслойки сетчатки или возникновение субретинального кровоизлияния могут повлиять на процесс гибели фоторецепторных клеток.
После наркотизации восьминедельной мыши подрежьте вибриссы животного, затем под хирургическим микроскопом расширьте зрачок раствором, содержащим 5% фенилефрина и 0,5% тропикамида. Удалите ресницы животного, примените местную анестезию, используя 0,5% офтальмологический раствор прокаина гидрохлорида. Поместите мышь в латеральное положение носом к хирургу, после чего сделайте разрез височной конъюнктивы у заднего края лимба, отделяя конъюнктиву от склеры с помощью пинцета.
Захватите конъюнктиву в области лимба, чтобы зафиксировать глаз. Затем, удерживая иглу 30 gauge срезом вверх, с помощью кончика иглы сформируйте туннель через склеру, проколов ее до достижения хориоидеи, не повреждая сетчатку.
Затем, удерживая иглу 30 G параллельно радужке, проколите роговицу, чтобы снизить внутриглазное давление. Теперь, направив срез иглы вниз, введите иглу 33 G, соединенную со шприцем Гамильтона объемом 10 µL, в субретинальное пространство и введите 3,5 µL урината натрия.
Это приведет к отслойке примерно 50% нейросенсорной сетчатки от подлежащего ретинального пигментного эпителия. С помощью пинцета надавите на роговицу вокруг места прокола, чтобы передняя камера глаза опорожнилась через прокол роговицы, затем с помощью хирургического целлюлозного зонда убедитесь в отсутствии утечки из склеральной раны, чтобы снизить риск вытекания раствора урината натрия. Нанесите цианоакрилатный клей на склеральную рану, после чего прикрепите конъюнктиву обратно на ее исходное место.
Используйте покровное стекло для осмотра глазного дна и подтверждения создания локального отслоения сетчатки без субретинального кровоизлияния. В завершение нанесите в глаз антибактериальную мазь для снижения риска инфицирования. Держите мышь на грелке для предотвращения переохлаждения организма.
После нормализации артериального давления верните животное в клетку, когда оно выйдет из состояния наркоза. Чтобы оценить устойчивость отслойки сетчатки, вызванной данным протоколом, на третий, седьмой и 14-й дни после индукции отслойки были изготовлены криосрезы.
Для каждой временной точки использовали шесть глаз; для визуализации срезов применяли окрашивание гематилином и эозином, при этом на каждом срезе наблюдалась отслойка сетчатки, достигающая хрусталика.
Ни в одном глазу не было обнаружено признаков инфекции или повреждения хрусталика. После освоения этой операции она может быть выполнена примерно за пять минут. При проведении данной процедуры важно аккуратно выполнять каждый шаг, чтобы избежать утечки натрия, выраженного субретинального кровоизлияния или повреждения хрусталика, так как все эти факторы могут привести к гибели рецепторных клеток в отслоившейся сетчатке. После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как создавать экспериментальную отслойку сетчатки у грызунов с воспроизводимой и стабильной высотой отслойки без субретинального кровоизлияния.
Обзор
В данной статье представлен метод создания экспериментальной отслойки сетчатки у грызунов, позволяющий добиться воспроизводимой и стабильной высоты отслойки без возникновения субретинального кровоизлияния. Эта методика имеет решающее значение для изучения потери фоторецепторных клеток при заболеваниях сетчатки и оценки эффективности потенциальных методов лечения.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейробиология
- Офтальмология
- Экспериментальная биология
Теоретические основы
- Отслойка сетчатки имеет важное значение для изучения заболеваний сетчатки.
- Существующие методы могут приводить к вариативности высоты и стойкости отслойки.
- Субретинальное кровоизлияние может затруднить оценку гибели фоторецепторных клеток.
- Для получения стабильных результатов в исследованиях необходима надежная модель.
Цель исследования
- Разработать воспроизводимый метод создания отслойки сетчатки.
- Минимизировать риск возникновения субретинального кровоизлияния во время процедуры.
- Создать надежную модель для изучения гибели фоторецепторных клеток и потенциальных методов терапии.
Используемые методы
- Разрез височной конъюнктивы в области заднего лимба.
- Создание самогерметизирующего склерального разреза и пункция роговицы.
- Инъекция урината натрия в субретинальное пространство.
- Нанесение цианоакрилатного клея для герметизации склеральной раны.
Основные результаты
- Успешное создание буллезных отслоек сетчатки без кровоизлияний.
- Высота отслойки и ее устойчивость были стабильными во всех опытах.
- После процедуры не наблюдалось признаков инфекции или повреждения хрусталика.
- Метод может быть выполнен примерно за пять минут.
Выводы
- Данный метод позволяет надежно моделировать отслойку сетчатки у грызунов.
- Он облегчает изучение механизмов, лежащих в основе гибели фоторецепторных клеток.
- Метод прост и воспроизводим, что делает его подходящим для различных исследовательских целей.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для отрасли
Создание воспроизводимых моделей отслойки сетчатки без сопутствующего кровоизлияния имеет решающее значение для снижения рисков при валидации мишеней при регенеративных заболеваниях сетчатки. Данный метод позволяет проводить механистические исследования гибели фоторецепторных клеток и обеспечивает согласованную оценку терапевтических воздействий в рамках доклинических исследований.
Стратегические области применения в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранний поиск и валидация мишеней
- Научная ценность: позволяет проверять терапевтические гипотезы, предоставляя контролируемую модель отслойки сетчатки для оценки выживаемости фоторецепторов при воздействии на конкретные сигнальные пути.
- Операционная ценность: снижает биологическую вариабельность, вызванную кровоизлияниями или нестабильной высотой отслойки, что повышает воспроизводимость результатов в различных лабораториях.
- Прогностическая ценность: способствует приоритизации портфеля препаратов, обеспечивая надежное сравнение соединений-кандидатов, направленных на борьбу с дегенерацией, вызванной отслойкой.
Скрининг и разработка анализа
- Научная ценность: позволяет получить количественные гистологические показатели (например, толщину слоя фоторецепторов с помощью окрашивания криосрезов) для анализа зависимости «доза — ответ».
- Практическая ценность: стандартизированные этапы хирургического вмешательства (самозатягивающийся разрез, нанесение клея) повышают готовность метода к проведению анализа и снижают частоту процедурных ошибок.
- Масштабируемость: короткое время проведения процедуры (~5 минут) и минимальные требования к оборудованию позволяют проводить высокопроизводительные скрининговые кампании.
Трансляционные и доклинические исследования
- Значимость для изучения заболеваний: Моделирует патофизиологию регматогенной отслойки, диабетической ретинопатии и ВМД, при которых накопление субретинальной жидкости вызывает дегенерацию.
- Трансляционная преемственность: Позволяет проводить лонгитюдную оценку сохранения отслойки (на 3, 7 и 14-й дни), что соответствует клиническим окнам прогрессирования.
- Механистическое снижение рисков: Изолирует гибель фоторецепторов от геморрагических искажающих факторов, что повышает достоверность показателей взаимодействия с мишенью.
Интеграция конвейера и рабочего процесса
Данная модель вписывается в континуум от этапа поиска до доклинических исследований, обеспечивая проверку гипотез на ранних стадиях поиска и предоставляя количественные показатели гистологического анализа для оптимизации соединений-лидеров и доклинической валидации.
- Фундаментальная биология: Поддерживает проверку гипотез, обеспечивая контролируемую индукцию отслойки сетчатки для изучения последующих дегенеративных каскадов.
- Скрининг: Обеспечивает воспроизводимые количественные результаты анализа тканей (например, срезы, окрашенные гематоксилином и эозином), позволяя сравнивать терапевтические эффекты при различных условиях.
- Аналитика: Позволяет определить измеримые структурные конечные точки (высота отслойки, ее продолжительность), что облегчает статистическое сравнение эффективности вмешательств.
- Трансляционные исследования: Связывает метод с доклинической валидацией посредством оценки прогрессирования отслойки и гистологических результатов во времени, что имеет значение для патологий отслойки сетчатки у людей.
- Корпоративное использование: Стандартизированный хирургический протокол позволяет внедрить данный метод в различных центрах в качестве универсальной платформы для скрининга дегенерации сетчатки.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Повышает точность прогнозирования за счет минимизации биологического шума, вызванного кровоизлиянием и вариабельной динамикой отслойки.
- Операционная ценность: Повышает воспроизводимость благодаря стандартизированным методам выполнения разреза и герметизации, что снижает вариабельность результатов между разными пользователями.
- Стратегическая ценность: Улучшает качество принятия решений о целесообразности дальнейшей разработки («go/no-go») за счет получения надежных сигналов эффективности в моделях дегенерации.
- Влияние на портфель: Позволяет осуществлять приоритизацию терапевтических средств с учетом рисков на основе согласованных данных о выживаемости фоторецепторов.
Особенности реализации
- Требуется опыт микрохирургических операций в офтальмологии грызунов и навыки работы с тканями.
- Зависит от наличия микрохирургических инструментов (иглы 30G/33G, пинцеты, хирургическое копье) и адгезивов (цианоакрилатный клей).
- Необходима стандартизация объема инъекции (3.5 µL гиалуроната натрия) и послеоперационного мониторинга между исследовательскими группами.
- Адаптация для моделей с более крупными глазами может потребовать корректировки калибра иглы и объема инъекции при сохранении принципов самогерметизации.
- Ограничена навыками оператора по предотвращению хориоидального кровоизлияния при пенетрации склеры, хотя использование хирургического копья снижает этот риск.
