Transsynaptic Трассировка из периферийных цели с Pseudorabies Касперского Вслед за холерного токсина и Биотинилированный декстран Амины Двухместный маркировки

Общая цель этой процедуры состоит в том, чтобы обнаружить центральную премоторную сеть распределенных клеток, которые воздействуют на конкретную периферическую мишень, а затем подтвердить специфические связи между этими клетками в мозге. Это достигается путем первого ретроградного заражения премоторных цепей транссинаптическим вирусным вектором, который доставляется периферически через мышцу. Вторым этапом процедуры является визуализация инфицированных клеток с помощью световой флуоресцентной микроскопии.

Третий шаг заключается в подтверждении специфических связей в мозге путем введения моносинаптических индикаторов, направленных на ранее идентифицированные узлы премоторной цепи. В конечном счете, результаты могут показать, как клетки в распределенной премоторной сети связаны друг с другом с помощью комбинации транссинаптического отслеживания вируса и традиционных моносинаптических нейроанатомических методов. Основное преимущество этой техники по сравнению с существующими методами, такими как традиционная моносинаптическая нейротрассировка, заключается в том, что узлы распределенной нейросети могут быть идентифицированы, а специфические связи между клетками в этой сети могут быть разрешены на мыши, находящейся под наркозом.

Подготовьте место операции, подстригая волосы и дезинфицируя кожу не менее чем тремя чередующимися скрабами бетадина и 70% спирта. Теперь сделайте разрез кожи в области горла и обнажите интересующую мышцу. Например, чтобы получить доступ к пятищитовидной гортанной мышце, необходимо сначала удалить вышележащую часть подъязычной мышцы Стерно и запечатать все разрезанные мышцы с помощью клея для тканей vet bond.

Затем загрузите 10 микролитровую систему микрошприцев со свежеразмороженным раствором PR RV. Медленно очистите мертвое пространство и убедитесь, что раствор выходит из наконечника микрошприца. Выбросьте жидкость как биологически опасные отходы и аккуратно установите ее на стереотаксическое устройство.

С помощью устройства микропозиционирования осторожно поместите кончик иглы в интересующую мышцу. Затем медленно заполняйте мышцу до тех пор, пока не станет заметна небольшая припухлость. Теперь переместите шприц к следующей интересующей мышце, в данном случае к латеральному крикоаритеноиду и повторите.

При процедуре инъекции только прокалывают каждую мышцу. Скорость инъекции будет варьироваться в зависимости от размера мышцы и объема инъекции. Например, пять инъекций по 200 нанолитров со скоростью четыре нанолитра в секунду должны быть сделаны с интервалом в одну и ту же минуту в одно и то же место, чтобы заполнить пятинощитовидную мышцу.

После втягивания микрошприца запечатайте разрыв в фасции с помощью клея для тканей vet bond. После того, как все инъекции будут завершены, закройте рану с помощью клея для тканей vet bond. Следите за животным до тех пор, пока у него не появится грудное лежачее положение.

Затем обеспечьте обезболивание, еду, воду и уход по мере необходимости вашего животного в учреждении. Используйте рекомендации. Процедура анализа экспрессии EGFP и инфицированных PRV нейронов подробно описана в текстовом протоколе.

Обработка тканей очень похожа на ту, о которой пойдет речь далее в этом видео. Начните с обезболивания взрослой мыши, защищая ее глаза и фиксируя положение головы. Затем подготовьте место операции, как описано ранее, чередуя скрабы с бетадином и 70% спиртом.

Теперь сделайте разрез на коже головы и втяните кожу головы над мозгом. Регион интересов. Выполните небольшую трепанацию черепа с помощью сверла в соответствующих стереотаксических координатах.

Например, координаты моторной коры головного мозга, соединенной с гортанью, идентифицированные с помощью трассировки PRV у взрослой мыши, находятся на расстоянии 1,2 миллиметра латерально и 0,2 миллиметра рострально от BGMA. Далее приготовьте 7,5%-ный раствор биотинилированных декстранаминов в стерильной воде. Затем загрузите в систему nano jet с двумя микропипетками достаточное количество раствора BDA для запланированных инъекций.

Медленно очистите мертвое пространство и убедитесь, что раствор выходит из наконечника микропипетки. С помощью устройства микропозиционирования осторожно опустите наконечник микропипетки в интересующую область мозга и медленно введите раствор BDA. Отрегулируйте скорость в зависимости от размера региона, который должен быть помечен

Например, 12 инъекций по 4,6 нанолитра должны быть сделаны в четырех разных местах. На расстоянии 0,2 миллиметра друг от друга. Stro покрывает моторную кору головного мозга гортани у взрослой мыши.

Окончательный объем впрыска должен быть скорректирован в соответствии с размером области интереса. Следует иметь в виду, что метка может диффундировать из ядра инъекции через ткани мозга и вдоль отростков меченых нейронов. Проведите чистую и влажную трепанацию черепа стерильным физиологическим раствором и закройте рану на коже головы с помощью клея для тканей vet bond.

Следите за животным до тех пор, пока у него не появится грудное лежачее положение. Затем обеспечьте обезболивание, еду, воду и уход по мере необходимости вашего животного в учреждении. Используйте рекомендации.

Через шесть дней субъединица холерного токсина B может быть введена в мышцы животного. Затем через три дня животное следует принести в жертву для проведения анализов. Разрезать срезы на 40 мкм на криостате и сохранить плавающие срезы в 0,1 моляра ПБС закалить срезы 0,3%-ной перекисью водорода в ПБС в течение 30 минут при встряхивании и в защищенном от света месте.

Промойте секции три раза в PBS в течение пяти минут за промывку. Затем вреагируйте их в течение часа в свежеприготовленном растворе А, в, С комнатной температуры. Теперь промойте срезы три раза в фосфатном буфере в течение 10 минут за одну стирку.

Затем проявляют срезы в течение восьми минут с перемешиванием в фосфатном буфере рН 7,4, содержащем DAB перекись водорода и хлорид никеля. Продукт реакции DAB внутри клеток должен казаться черным.

Затем заблокируйте срезы при встряхивании в течение 30 минут в PBS, содержащем 0,3%tween 20 с обычной сывороткой кролика из набора Vector Stain Elite. Далее инкубируйте заблокированные участки в козьем анти СТБ с встряхиванием в течение двух часов при комнатной температуре. Затем промойте срезы еще три раза в PBS по пять минут за одну стирку.

Нанесите вторичное антитело к антиго кролика из набора VE и инкубируйте срезы, встряхивая в течение одного часа при комнатной температуре. Промыть срезы трижды в PBS в течение пяти минут за одну промывку, а затем вступить в реакцию в течение 30 минут в свежеприготовленном растворе А, б, С комнатной температуры. Промойте срезы три раза в фосфатном буфере в течение 10 минут и инкубируйте срезы в течение восьми минут.

В растворе для разработки продукт реакции DAB внутри клеток должен казаться коричневым. Теперь установите секции на суперморозы и слайды на предметные стекла, обезвожьте ткань с помощью серии отсортированных спиртов, а затем промывайте две промывки в ксилоле. Затем накройте слайды с помощью парамаунта и приступайте к визуализации.

Окрашивание на EGFP должно начинаться со слабого сигнала в первичных моторных нейронах через 72 часа после введения P RV 1 52, а окрашивание становится устойчивым через 90 часов. Это неоднозначное ядро, в котором находятся моторные нейроны гортани, видно через 94 часа после инъекции P RV 1 52 в две из семи гортанных мышц. Потому что вирус проник в мозг через нейроны, которые иннервируют инфицированные мышцы.

Другие пулы моторных нейронов, такие как подъязычное ядро, не экспрессируют EGFP через 90 часов. EGFP можно увидеть в ячейках второго порядка. Эти нейроны ствола мозга были окрашены после первичной инфекции в ядре неоднозначного.

Инъекция была односторонней, и полученный рисунок метки в стволе мозга указывает на инфекцию ипсилатерального ядра. Неоднозначные и одиночные ретикулярные интернейроны ядра также были инфицированы и сильно окрашивались для EGFP. Эти интернейроны соединяют различные структуры, включая пулы моторных нейронов и контралатеральное ядро. Двусмысленный.

Однако их эфферентные мишени остаются непомеченными, потому что вирус распространяется только в ретроградном направлении. Время выживаемости при ПРВ ограничено, но может свидетельствовать о окрашивании EGFP в инфицированных клетках третьего и более высокого порядка премоторных нейронов в моторной коре, экспрессирующих EGFP контралатерально периферическому месту инъекции. Предположительно, инфицирована только популяция клеток, составляющих моторное корковое представление мускулатуры гортани.

Меченные BDA аксоны на уровне ядра неоднозначно помечены стрелками, вступают в контакт с CTB-положительными моторными нейронами, ретроградно мечеными инъекциями в гортанные мышцы, видимые коричневым цветом, аксоны образуют варикозные расширения вен и предполагаемые концевые батоны вблизи дендритов моторных нейронов гортани и вблизи сомы моторных нейронов гортани. Необходимы дальнейшие эксперименты с использованием электронной микроскопии или электрофизиологии, чтобы определить, являются ли эти варикозы синаптическими. Двусторонняя инъекция BDA, введенная в моторную кору гортани, видна черным цветом, потому что BDA не специфична по направлению, могут быть помечены как афферентные, так и эфферентные связи.

Например, в таламусе видны как проекционное поле антероградной метки, так и тела клеток, помеченные ретроградно. Таламические клетки идентифицируются по наконечнику стрелки, а внутренняя капсула помечается для ориентации. Не забывайте, что работа с вирусом псевдобешенства и DAB может быть чрезвычайно опасной, и такие меры предосторожности, как стерилизация.

Все материалы, которые контактировали с PRV или DAB, используют 10% раствор отбеливателя. При выполнении этой процедуры всегда следует принимать надлежащие меры по утилизации биологически опасных твердых и жидких отходов в соответствии с правилами вашего учреждения.