Микронного масштаба Разрешение оптической томографии целых мозг мышей с конфокальной Light Sheet микроскопии
8 октября 2013 г.
В этой статье мы расскажем полную экспериментальную процедуру восстановления, с высоким разрешением, тонкой анатомии мозга флуоресцентно меченых мозгах мыши. Описанный протокол включает подготовку образца и очистки, образец монтажные для изображений, данных постобработки и многомасштабной визуализации.
Общая цель данной процедуры заключается в реконструкции и визуализации всего мозга мыши с разрешением микронного масштаба. Это достигается путем предварительного обезвоживания фиксированного мозга мыши, интегрированного в тетраэдральный ряд. На втором этапе образец подвергается просветлению в бензиловом эфире.
Затем проводится визуализация мозга с помощью конфокального микроскопа с листовым освещением. Заключительным этапом является использование программного обеспечения для выравнивания и сшивания полученных стеков изображений. В итоге для навигации по реконструированному объему изображения можно использовать инструмент многомасштабной визуализации.
Главное преимущество данной методики перед другими методами, такими как конфокальная или двухфотонная микроскопия, заключается в том, что весь объем мозга мыши может быть визуализирован всего за несколько дней. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы нейробиологии, такие как распределение различных типов нейронов по всему мозгу. Позволяет ли этот метод получить представление о тонкой анатомии мозга?
Этот метод может быть применен также к эмбрионам мыши или плодовому дрозофиле, что доказывает воспроизводимость процедуры. Работа была выполнена аспирантом моей лаборатории. Для начала данного протокола проведите стандартную фиксацию головного мозга мыши путем транскардиальной перфузии и проведите постфиксацию в течение ночи перед дегидратацией и просветлением.
Поскольку растворитель для дегидратации, THF, сильно гасит флуоресценцию XFP, проведите фильтрацию для удаления пероксидов с использованием базового активированного оксида алюминия в хроматографической колонке; избегайте растрескивания колонки, что может снизить эффективность удаления пероксидов, перед добавлением стабилизатора в конечный раствор. Даже если THF был стабилизирован до фильтрации, стабилизатор будет задержан оксидом алюминия. Обратите внимание, что в THF без стабилизатора могут образовываться большие количества пероксидов, что может привести к взрыву и создать опасную ситуацию.
Затем проведите обезвоживание серий срезов целого мозга мыши, интегрированных в THF, в чистой воде. После этого поместите флакон с образцом на вращающееся колесо, чтобы избежать воздействия света. Оберните флакон алюминиевой фольгой.
Наконец, профильтруйте осветляющий растворитель через оксид алюминия, используя фильтровальную воронку. Затем проведите осветление образца в 100% DBE, заменяя раствор через три и шесть часов, когда мозг станет прозрачным. Обычно через один час после второй замены DBE зафиксируйте образец на наклонной планшете для визуализации одним из описанных здесь методов.
Прямое монтирование с использованием диска из агарозы или монтирование через агарозный держатель для прямого закрепления: осторожно погрузите образец на один из наконечников, используя диск из 6% агарозного геля на наконечниках. Затем осторожно зафиксируйте образец на агарозном диске акриловым клеем и подождите около одной минуты до полного отверждения для завершения монтирования.
С помощью погружного стакана agros заполните стакан 3% гелем agros до кончиков. Затем осторожно поместите образец на дно стакана. После закрепления образца одним из этих методов с помощью пинцета поместите пластину для визуализации в камеру для образцов.
Затем заполните камеру осветляющим раствором. Далее подготовьтесь к томографии. Сначала удалите щель, чтобы собрать как можно больше флуоресценции, а затем осветите образец лазером низкой мощности.
Чтобы предотвратить фотовыгорание, переместите образец по трем осям x, y и Z, используя систему микропозиционирования с программным управлением. Для каждого направления определите минимальные и максимальные координаты, при которых образец освещен и находится в поле зрения камеры. Затем введите определенные координаты в качестве параметров для подпрограммы предварительной томографии.
Также укажите расстояние между соседними стеками, которые будут использоваться при томографии, и шаг дискретизации в направлении Z на этапе предварительной томографии. Наконец, запустите предварительную томографию, в ходе которой будут собраны изображения в каждом стеке с параметрами дискретизации по Z, указанными на предыдущем шаге. Чтобы начать сбор данных, сначала переместите образец за пределы светового листа с помощью системы микропозиционирования.
Затем увеличьте мощность лазера и остановите движение всех сканирующих систем, чтобы осветить только одну фиксированную линию в центре поля зрения. Далее установите щель и выровняйте её, используя сигнал автофлуоресценции раствора для просветления. Теперь в центре поля зрения должна быть четко видна линия щели.
Теперь снова активируйте систему сканирования. Снизьте мощность лазера и переместите образец внутрь светового листа с помощью системы микропозиционирования. Обратите внимание, что мощность лазера при использовании щели будет выше, чем без нее.
Поскольку пространственный фильтр блокирует значительную часть света, отрегулируйте амплитуду и смещение систем сканирования и d-сканирования с помощью управляющего программного обеспечения до тех пор, пока изображения не станут четкими и яркими. Затем установите соответствующий шаг по оси Z для данного эксперимента и запустите программу для томографического сбора данных. Объем будет визуализирован в виде множества параллельных, частично перекрывающихся стеков, а изображения будут сохранены в иерархической структуре папок.
Чтобы программное обеспечение для сшивания могло работать с полным кубическим объемом, дополните полученный объем синтетическими черными изображениями (изображениями того же типа и размеров, что и собранные, но с нулевой интенсивностью) с помощью автоматизированного ПО. Затем запустите программное обеспечение VA A 3D с установленными плагинами Terra, Stitcher и tarly и загрузите плагин Terra Stitcher. Выберите каталог, содержащий изображения объема, и укажите относительную ориентацию осей по отношению к эталонной правой системе координат, а также размер вокселя.
Теперь запустите первую часть сшивания. Программное обеспечение рассчитает относительное смещение между парами стеков и определит общее оптимальное расположение для всех стеков вместе; выберите сохранение сшитого объема в формате одинакового или множественного разрешения. Последний вариант позволяет осуществлять визуализацию в нескольких разрешениях с помощью плагина tarly.
В обоих случаях, если изображение с более высоким разрешением превышает несколько гигабайт, также выберите режим сохранения в виде нескольких стеков (multi-stack save) и укажите размер отдельных подстеков. Это обеспечит эффективный доступ к сохраненным данным. Теперь запустите вторую часть сшивки.
Программное обеспечение объединит выровненные стеки и сохранит их либо в режиме одного стека, либо в режиме нескольких стеков. По завершении закройте плагин Terra Stitcher. Затем загрузите плагин terra fly.
Выберите папку с многослойным томом в нескольких разрешениях, укажите размер отверстия (foxhole size) и ориентацию осей. Том будет загружен с минимальным разрешением. Для перехода к более высокому разрешению просто используйте колесико мыши.
В качестве альтернативы можно дважды щелкнуть по определенной точке изображения, выбрать функцию масштабирования вокруг существующего ориентира или напрямую указать координаты интересующего объема. Чтобы вернуться к более низкому разрешению, просто используйте колесико мыши. Описанный протокол может быть использован для реконструкции с микронным разрешением как целого мозга мыши, так и его отделяемых частей без необходимости физического секционирования.
В качестве репрезентативного результата здесь представлен весь мозжечок мыши линии L7 GFP на 10-й постнатальный день. Все нейроны Пуркинье помечены EGFP. При увеличении видна типичная пластинчатая структура коры мозжечка; дальнейшее увеличение позволяет четко различить сому каждой клетки Пуркинье.
Таким образом, описанный протокол может быть использован для анализа пространственной организации нейронов в различных исследованиях нейроразвития. В качестве второго репрезентативного результата здесь представлены изображения срезов мозга взрослой мыши линии GFPM. У этого трансгенного животного EGFP экспрессируется в случайном разреженном подмножестве нейронов.
Здесь показана правая половина мозга. При дальнейшем увеличении становятся различимы нейрональные отростки. Этот результат демонстрирует, что описанный протокол позволяет получать изображения всего мозга взрослой мыши с микронным разрешением, что открывает возможность изучения анатомии всего мозга на клеточном уровне.
В моделях нейродегенеративных заболеваний у мышей. После освоения данной методики ее выполнение при правильном подходе занимает от трех до четырех дней. При выполнении этой процедуры важно помнить о необходимости тщательной фильтрации растворов для обезвоживания и очистки для сохранения флуоресценции GFP. Представленный здесь инструмент визуализации с переменным разрешением также может быть использован для исследования очень больших наборов данных, полученных с помощью других методов, таких как микрооптическая секционная томография.
После просмотра этого видео вы должны хорошо понимать, как проводить окрашивание, расчет индекса и очистку фиксированного мозга мыши. Вы узнаете, как выполнять их визуализацию с помощью конфокальной микроскопии светового листа и рассматривать реконструированный объем в VR 3D с использованием плагина Tely.
Обзор
В данной статье представлен подробный протокол реконструкции тонкой анатомии мозга мыши с флуоресцентной меткой в высоком разрешении. Процедура включает в себя подготовку образцов, просветление, визуализацию и последующую обработку данных.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейронауки
- Методы визуализации
- Анатомия мозга
Теоретические основы
- Понимание структуры мозга имеет решающее значение для нейробиологических исследований.
- Флуоресцентное мечение позволяет детально визуализировать анатомию мозга.
- Методы визуализации с высоким разрешением могут выявить распределение типов нейронов.
- Данный метод также может быть применен к другим образцам, например, к эмбрионам мышей.
Цель исследования
- Разработать протокол для получения изображений высокого разрешения головного мозга мыши.
- Облегчить изучение распределения нейронов по всему мозгу.
- Предложить метод, который является более быстрым, чем традиционные методы визуализации.
Используемые методы
- Дегидратация фиксированного мозга мыши с использованием THF.
- Прояснение образцов в бензиловом эфире для достижения прозрачности.
- Визуализация с помощью конфокального микроскопа с плоскостным освещением (light sheet microscope).
- Сшивка и выравнивание данных с использованием специализированного программного обеспечения.
Основные результаты
- Данный протокол позволяет выполнить визуализацию всего мозга мыши за несколько дней.
- Возможна реконструкция и визуализация изображений с высоким разрешением.
- Метод позволяет детально изучить анатомию мозга.
- Он обеспечивает возможность исследования типов нейронов и их распределения.
Выводы
- Данный метод визуализации значительно расширяет возможности изучения анатомии мозга.
- Он применим к различным биологическим образцам, помимо головного мозга мыши.
- Данный протокол может помочь в решении ключевых вопросов нейробиологии.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для промышленности
Визуализация всего мозга с высоким разрешением позволяет проводить валидацию мишеней и снижение механистических рисков при поиске нейробиологических лекарственных средств, обеспечивая пространственный контекст микронного масштаба для нейрональных фенотипов. Эта возможность повышает прогностическую уверенность в связывании с мишенью и в исследованиях механизмов действия на уровне нейронных сетей. Данный метод ускоряет характеристику доклинических моделей и согласование трансляционных биомаркеров для разработки терапевтических средств при заболеваниях ЦНС.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранний поиск и валидация мишеней
- Научная ценность: Позволяет проверять терапевтические гипотезы посредством картирования всего мозга с использованием флуоресцентно-меченых популяций нейронов.
- Операционная ценность: Обеспечивает снижение биологических рисков за счет визуализации взаимодействия с мишенью и внецелевых эффектов в структуре целого мозга.
- Прогностическая ценность: Способствует приоритизации портфеля проектов за счет получения количественных пространственных данных о распределении нейронов и модуляции путей.
Скрининг и разработка метода анализа
- Научная ценность: Подготовка валидированных, очищенных биологических систем для стандартизированных и воспроизводимых рабочих процессов скрининга на основе визуализации.
- Практическая ценность: Обеспечение готовности анализа за счет получения высококонтрастных изображений неповрежденных образцов с микронным разрешением.
- Масштабируемость: Обеспечение повторного использования платформы с помощью программных инструментов с открытым исходным кодом для сшивания и многомасштабной навигации по наборам данных терабайтного объема.
Трансляционные и доклинические исследования
- Трансляционная непрерывность: обеспечивает связь между картированием нейронов на этапе открытия и доклинической валидацией с использованием релевантных моделей заболеваний мозжечка и всего головного мозга.
- Продвижение с учетом рисков: поддерживает принятие решений о продолжении или прекращении исследований (go/no-go) за счет визуализации нейродегенеративных фенотипов в интактном мозге взрослых мышей с клеточным разрешением.
- Механистическое снижение рисков: позволяет изучать пространственную организацию нейронов в моделях нейроразвития и заболеваний без физического секционирования.
Интеграция конвейера и рабочего процесса
Данный метод интегрируется в процесс поиска новых лекарственных средств — от проверки гипотез относительно мишеней и идентификации ведущих соединений до доклинической валидации — обеспечивая получение количественных нейроанатомических данных с пространственным разрешением.
- Открывающая биология: обеспечивает проверку гипотез и уточнение сигнальных путей посредством визуализации всего мозга подмножеств нейронов, меченных EGFP, в трансгенных моделях.
- Скрининг: обеспечивает готовность анализа и воспроизводимость за счет конфокальной светолистной микроскопии просветленных образцов с минимальным фотообесцвечиванием.
- Аналитика: позволяет получать количественные данные с различным разрешением для сравнения распределения и морфологии нейронов в разных экспериментальных условиях.
- Трансляционные исследования: обеспечивают преемственность с доклиническими исследованиями путем визуализации соответствующих моделям заболеваний, таких как мыши L7-GFP и thy1-GFP-M.
- Корпоративное повторное использование: создает возможность многократного использования системы визуализации за счет стандартизированных протоколов просветления, монтирования и программных конвейеров сшивки изображений.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Повышение прогностической уверенности при валидации мишеней за счет получения изображений всего объема мозга с микронным разрешением.
- Операционная ценность: Стандартизация и воспроизводимость благодаря фильтрации растворителей, протоколам просветления тканей и автоматизированным рабочим процессам сшивания изображений.
- Стратегическая ценность: Оптимизация принятия решений о продолжении или прекращении разработки (go/no-go) за счет снижения биологических рисков на поздних этапах программ по ЦНС путем раннего фенотипического анализа рисков.
- Влияние на портфель: Приоритизация с учетом рисков, ставшая возможной благодаря картированию типов нейронов и паттернов их проекций во всем мозге.
Особенности реализации
- Требуются экспертные знания в области просветления тканей, флуоресцентной микроскопии и управления данными 3D-изображений.
- Зависимость от систем конфокальной микроскопии светового листа и высокопроизводительных вычислений для обработки наборов данных терабайтного масштаба.
- Необходима межкомандная стандартизация процедур дегидратации, просветления и монтирования для сохранения флуоресценции GFP.
- Требуется учет особенностей адаптации для различных флуоресцентных меток и растворителей для просветления в разных модельных системах.
- Существуют практические ограничения, такие как образование пероксидов в THF, что требует фильтрации для предотвращения тушения флуоресценции и устранения рисков безопасности.
