Флуоресцентный экзонуклеазный анализ для характеристики dmWRNexo, ортолога прогероида человеческого WRN экзонуклеазы, и его применения к другим нуклеазам

В этом эксперименте для определения активности экзонуклеазы используется надежный воспроизводимый флуоресцентный анализ. Инкубируйте очищенный фермент с флуоресцентным субстратом ДНК, чтобы позволить ферменту последовательно разлагать ДНК. Затем разрешите ДНК на акриламидном геле мочевины, чтобы разделить продукты распада по размеру.

Затем используйте флуоресцентную визуализацию для идентификации и количественной оценки степени активности экзонуклеазы. Проанализированные результаты позволяют определить предпочтительные условия реакции субстрата, процессную и общую активность фермента. Основное преимущество этого метода по сравнению с существующими методами, основанными на радиоактивности, заключается в том, что субстраты ДНК стабильны в течение длительного времени, что обеспечивает превосходную воспроизводимость, снижает стоимость и повышает безопасность.

Во-первых, отрегулируйте бактериальный лизат до 20 миллимоляров, используя соответствующий объем двухмолярного исходного раствора. Затем отрегулируйте объем по крайней мере до одного миллилитра, используя 20 миллимоларных промывочных материалов, один миллилитр колонны ловушки с 10 миллилитрами воды milli Q. Затем уравновесьте колонку 10 миллилитрами 20 миллимолярного оле.

Затем загрузите лизат в колонку, по мере того как лизат загружается на колонку, может возникнуть значительное противодавление. Это совершенно нормально. Не поддавайтесь искушению прикладывать слишком большое усилие к шприцу и поддерживайте постоянное равномерное давление.

Обычно наблюдается незначительное изменение цвета при попадании лизата в колонку. Соберите сток через стерильную бутылочку емкостью семь миллилитров и храните на льду. Затем промойте колонку 10 миллилитрами 20 миллимолярных выделений оле.

Теперь пропустите через колонку пять миллилитров 40 миллимолярного йоля. Внимательно следите за поршенем шприца, чтобы отмерить доли в один миллилитр, которые собираются в каждую из микропробирок. Аналогично последовательно пропустите через себя пять миллилитров каждой концентрации йола и каждый раз соберите пять долей по одному миллилиру.

Анализ фракций методом точечного блоттинга и зондирования с помощью конъюгированного HRP-антитела против шипения. Для определения пиковых долей. Держите все реагенты при температуре четыре градуса Цельсия в соответствии с основной смесью и стерильной смесью без ДНК объемом 0,5 миллилитра. Микропробирки также включают в себя контроль без ферментов для визуализации исходного субстрата.

Теперь установите тепловой блок на температуру, соответствующую активности фермента. Приготовьте IDE, содержащую стоп-раствор, и храните его при комнатной температуре. Организуйте рабочее пространство рядом с тепловым блоком, включая конечные реагенты, которые будут добавлены в реакцию.

Смешайте дозатор от одного до 10 микролитров в наконечниках, таймер, криорешетку или ведро для льда и остановите раствор. Запустите таймер по добавлению фермента в первую пробирку и поместите пробирку в нагревательный блок. Продолжайте добавлять фермент в остальные трубки с интервалом в 15 секунд и поместите трубки в нагревательный блок, когда таймер достигнет нужного времени.

Добавьте 10 микролитров стопового раствора к первому образцу и перемешайте с помощью пипетирования. Продолжайте останавливать реакции через соответствующие промежутки времени и в том же порядке, в котором они были настроены, чтобы каждая реакция имела точно такую же инкубационную загрузку: половину или весь образец на акриламидный гель. Раствор с одной остановкой, содержащий краситель, на одной или нескольких дорожках, чтобы убедиться в том, как работает гель.

После электрофореза удалите спейсеры и одну гелевую пластину. Тщательно промойте и тщательно протрите гелевую пластину, чтобы удалить следы выпавшей мочевины. Установите пластину с гелем на стеклянное пространство гелевого держателя и при необходимости поместите ее в тепловизор.

Обратите внимание на координаты геля на стекле. Откройте соответствующее программное обеспечение и отсканируйте отмеченную область области сканирования, используя условия, описанные в текстовом протоколе. Обрежьте изображение и сожмите данные.

При необходимости сохраните, а затем экспортируйте в файл для анализа. Проведение анализа активности экзонуклеазы in vitro требует проведения ряда подготовительных этапов. В дополнение к фактическому анализу этих флуоресцентных экзонуклеазных анализов, крайне важно оптимизировать обнаружение системы флуоресцентной визуализации.

Например, для олигонуклеотидной подложки, меченной флуоресцеином, требуется фильтр, который допускает возбуждение на частоте 470 нанометров и излучение на частоте 520 нанометров. Используя этот фильтр, можно повысить способность обнаруживать низкие концентрации субстрата или продукта, регулируя как чувствительность, так и разрешение тепловизора. Обратите внимание, что существует некоторый допуск с точки зрения пропускной способности фильтра.

Как неоптимальный выбор фильтра все еще позволяет частично обнаруживать подложку, хотя и с гораздо более низкой чувствительностью. Подходящая комбинация меченой концентрации олигонуклеотида и настроек имидж-сканера может привести к надежному обнаружению субстрата. Это важно, поскольку продукты распада при инкубации с активной экзонуклеазой будут присутствовать в меньших количествах в каждой полосе, так как субстрат был последовательно фрагментирован.

Успешный анализ экзонуклеазы вызовет деградацию субстрата последовательно по отношению к флоре. В-четвертых, в результате чего на геле образуется характерный лестничный узор ДНК, представляющий деградацию экзонуклеазы. После оптимизации для обнаружения анализ может быть использован для обнаружения дифференциальной активности как в качественном, так и в количественном отношении.

Например, наличие или отсутствие активности может быть определено для нуклеазных мутантов по сравнению с белком дикого типа. Различные субстраты также могут быть проверены на их способность разлагаться нуклеазой. Под следствием.

Этот анализ in vitro может быть использован для проверки специфичности субстрата и процесса нуклеазы, представляющей интерес.