Multiplexed Люминесцентная микрочипов для человека слюнных анализа белка с использованием полимерных микросфер и волоконно-оптических Связки
10 октября 2013 г.
Мы описываем процедуру для профилирования белки слюны, используя мультиплексированных массивы антител микросфер на основе. Моноклональные антитела ковалентно связаны с флуоресцентными красителями кодируется 4,5 мкм полимерных микросфер с использованием карбодиимида химии. Модифицированные микросферы были депонированы в волоконно-оптических лунки для измерения уровня белка в слюне с помощью сэндвич-флуоресценции иммунологические.
Общая цель этой процедуры заключается в анализе нескольких белков в образцах слюны человека с использованием флуоресцентных матриц на основе микросфер. Во-первых, закодируйте микросферы с помощью двух флуоресцентных красителей в разном количестве. Соедините антитела захвата для различных белков с закодированными микросферами.
Затем соберите мультиплексированный белковый микрочип на оптоволоконном пучке, используя сэндвич-иммунологические анализы на собранных микрочипах для нескольких белков в образцах тестовой слюны. В конечном счете, анализ с помощью флуоресцентной микроскопии может измерить сигнальные отклики различных белков в образцах слюны. Основное преимущество этого метода перед существующими методами, подобными методу Элизы, заключается в том, что он позволяет проводить одновременный анализ нескольких белков в сложных биожидкостях.
Хотя этот метод может дать представление об анализе слюны человека, он также может быть применен к другим биогриппам, таким как сыворотка мочи и мокрота. Взвесьте ТТА опиума во флаконе из янтарного стекла и приготовьте 200 миллимолярный исходный раствор в тетрагидро фурине. Аккуратно перемешайте с помощью пипетки и визуально убедитесь, что краситель полностью растворился.
Аналогичным образом приготовьте 12-миллимолярный стоковый раствор Кумарина 30, аккуратно перемешанный с помощью пипетирования. Зрительно. Убедитесь, что D полностью растворил вихрь в микросфере суспензии, а затем переложите 60 микролитров в микроцентрифугу объемом 1,5 миллитра. Чтобы промыть микросферы, добавьте 600 микролитров PBS, смешанных пипетированием 20 раз и центрифугируйте при 10 000 об/мин в течение трех минут.
После трех промываний раствором тетра гидрофурина удалите надосадочную жидкость, ресуспендируйте небо в 600 микролитрах рабочего раствора, и переложите смесь в новую микроцентрифугу объемом 1,5 миллитра. Запечатайте микроцентрифужную пробирку пара-пленкой и поместите ее на шейкер. Защитите его от света, накрыв алюминиевой фольгой.
Добавьте 200 микролитров закодированной микросферной суспензии в сейфовый замок, 1,5 миллилитровую микроцентрифужную пробирку. По каплям добавьте 150 микролитров свежеприготовленного раствора EDC Немедленно добавьте 150 микролитров сульфаниламидного раствора NHS. Хорошо перемешайте с помощью пипетирования и убедитесь, что суспензия однородна.
Закройте пробирку крышкой, запечатайте ее параформой и поставьте на шейкер. Защитите его от света, накрыв алюминиевой фольгой. После трех промывок буферной смеси P-B-S-S-D-S суспендируйте гранулу в 200 микролитрах буферной смеси P-B-S-S-D-S.
Ну а затем перелейте раствор в 300 микролитров буфера P-B-S-S-D-S, содержащего 60 микрограмм антител захвата. Смешайте по 50 микролитров каждого типа микросфер для захвата белка в новой автоклавной микроцентрифужной пробирке. Центрифугируйте стандартный бассейн микросфер при 7000 об/мин в течение трех минут и удалите все, кроме 100 микролитров надосадочной жидкости.
Теперь вручную вырежьте оптоволоконные пучки примерно до пяти сантиметров в длину, последовательно отполируйте оба конца с помощью алмазных притирочных пленок. Затем обработайте полированный пучок ультразвуком в деионизированной воде в течение двух минут. Чтобы удалить любые частицы, поместите небольшую магнитную мешалку в микроцентрифужную пробирку объемом 0,5 миллилитров.
Добавьте 400 микролитров буфера PBS без белка и перемешивайте на магнитной пластине для перемешивания в течение 30 минут. Чтобы удалить пузырьки воздуха, протравите один конец полированного пучка волокон в 0,025 обычного раствора хлористого водорода в течение 150 секунд. Немедленно погрузите и обработайте вытравленный N ультразвуком в деионизированной воде в течение одной минуты.
Затем высушите пучки волокон сжатым воздухом, установите пучок волокон на держатель волокна и заблокируйте протравленный конец в буфере PBS без пузыря без белка на один час, нанесите на протравленный конец оптоволоконного пучка квадрат ALI объемом в один микролитр хранящейся микросферной суспензии. Защитите установку от света коробкой, обернутой алюминиевой фольгой. Через 15 минут объем суспензии уменьшится за счет испарения и вытеснит микросферы в протравленные микролунки.
С помощью тампона, пропитанного раствором образца, удалите микросферы, которые не попали в микролунки. Чтобы сделать белковый микрочип готовым к использованию, добавьте 200 микролитров раствора образца в автоклавную микроцентрифугу объемом 0,5 миллилитра. Опустите в раствор белковый микрочип, загруженный на волокно, и поместите на шейкер.
Беречь от света, накрыв алюминиевой фольгой. Затем опустите белковый микрочип в новую автоклавную микроцентрифужную пробирку, содержащую 200 микролитров буфера для промывки, и встряхните при 600 оборотах в минуту в течение двух минут. Теперь инкубируйте микрочип в 100 микролитровом растворе коктейля антител для обнаружения, содержащего биотинилированные антитела для обнаружения и буфер для блокирования PBS в течение 30 минут.
При комнатной температуре в темное время суток очистите дистальный конец пучка волокон тампоном, пропитанным абсолютным этанолом. Затем высушите оба конца волокна сжатым воздухом, установите волокно на эпифлуоресцентный микроскоп и проведите изображение через дистальный конец волокна, получите микросферные изображения, соответствующие интенсивностям флуоресцентных излучений опия TTAC 30 и SAP. Здесь представлены кодирующие изображения семи типов микросфер.
В кодирующем изображении UTTA наблюдаются два уровня интенсивности, которые обозначают микросферы, закодированные разным количеством кристалла UTTA. Аналогичные результаты наблюдаются в изображении, кодирующем C 30. Анализ изображений с помощью MATLAB позволяет рассчитать интенсивности флуоресценции различных микросфер на сигнальном изображении. Результаты декодирования показаны на рисунке 2D семь.
Различные микросферы успешно расшифровываются. Микросферы не проявляют реакции при инкубации с буфером для анализа. При инкубации с образцами человеческой слюны наблюдаются значительные флуоресцентные реакции.
Для лучшего сравнения контрасты на этих двух рисунках были скорректированы до одного и того же уровня. После освоения этого метода можно проводить воспроизводимый анализ различных белков в образцах слюны человека. Показаны результаты трех независимых детектирований на одном и том же образце.
После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как приготовить мультиплексный белковый микролуч на основе микросферы и использовать его для сложного анализа биожидкостей. Следуя этой процедуре. Другие белковые биомаркеры в различных сложных биожидкостях также могут быть проанализированы.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данной статье описывается процедура профилирования белков слюны с использованием мультиплексных антитело-содержащих микросферических массивов. Этот метод позволяет проводить одновременный анализ нескольких белков в образцах слюны человека, расширяя возможности традиционных методов анализа.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейробиология
- Биотехнология
- Протеомика
Теоретические сведения
- Слюна содержит множество белков, анализ которых может дать ценную информацию о состоянии здоровья и заболеваниях.
- Традиционные методы, такие как ELISA, ограничены анализом одного белка за один раз.
- Мультиплексные анализы позволяют повысить эффективность и информативность данных.
- Технология флуоресцентных микросфер предлагает новый подход к детектированию белков.
Цель исследования
- Разработать метод одновременного анализа нескольких белков в слюне.
- Повысить чувствительность и специфичность обнаружения белков в сложных биожидкостях.
- Предложить более эффективную альтернативу существующим анализам на один аналит.
Используемые методы
- Маркировка микросфер флуоресцентными красителями.
- Ковалентное связывание захватывающих антител с микросферами.
- Сборка мультиплексных белковых микромассивов на волоконно-оптических пучках.
- Использование флуоресцентного сэндвич-иммуноанализа для обнаружения белков в образцах слюны.
Основные результаты
- Метод позволил успешно обнаружить несколько белков в образцах слюны.
- Флуоресцентная микроскопия обеспечила четкий сигнал отклика для различных белков.
- Данная методика продемонстрировала преимущества перед традиционными методами ELISA.
- Результаты указывают на возможность применения метода в клинической диагностике.
Выводы
- Данный мультиплексный подход позволяет эффективно анализировать белки слюны.
- Этот метод может способствовать более глубокому пониманию различных состояний здоровья.
- Будущие исследования могут расширить область применения данной методики и для других биологических жидкостей.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для промышленности
Мультиплексный анализ белков в сложных биожидкостях, таких как слюна, позволяет устранить критическое узкое место в поиске биомаркеров, где традиционные однокомпонентные анализы ограничивают пропускную способность и увеличивают расход образцов. Данный волоконно-оптический массив на основе микросфер обеспечивает одновременное количественное определение нескольких белков слюны, что повышает эффективность анализа и способствует валидации мишеней на ранних стадиях исследования нейродегенеративных и воспалительных заболеваний. Обеспечивая количественные, воспроизводимые результаты при использовании ограниченного объема клинических образцов, данный метод повышает прогностическую достоверность при идентификации ведущих соединений и в рабочих процессах по снижению рисков на доклиническом этапе.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Первичный поиск и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет проверять терапевтические гипотезы путем одновременного измерения нескольких слюнных белковых биомаркеров в образцах, имеющих значение для исследования заболевания.
- Практическая ценность: снижает требования к объему образцов и сокращает сроки проведения анализа за счет параллельного детектирования белков в рамках одного рабочего процесса.
- Прогностическая ценность: способствует разработке панелей биомаркеров и валидации функциональных мишеней путем корреляции ответов нескольких аналитов с фенотипическими результатами.
Скрининг и разработка анализа
- Научная ценность: позволяет получать стандартизированные количественные данные флуоресценции для шести белков с использованием кодированных микросфер, что обеспечивает воспроизводимость результатов анализа между разными сериями измерений.
- Практическая ценность: способствует стандартизации анализа за счет иммобилизации оптоволоконного пучка и использования алгоритмов автоматического декодирования, что снижает вариабельность, зависящую от оператора.
- Масштабируемость: поддерживает повторное использование платформы для других биожидкостей (сыворотки крови, мочи, мокроты), как отмечено в транскрипте, что расширяет область применения метода за пределы анализа слюны.
Трансляционные и доклинические исследования
- Трансляционная непрерывность: обеспечивает связь между этапами открытий и доклиническими исследованиями, предоставляя клинически значимые данные о белках слюны, которые могут быть использованы для создания механистических моделей.
- Снижение механистических рисков: позволяет проводить анализ на уровне сигнальных путей с помощью мультиплексного детектирования, что уменьшает неопределенность при оценке взаимодействия с мишенью и биологического ответа.
- Прогностическая достоверность: обеспечивает количественные флуоресцентные ответы сигналов, которые служат основанием для принятия решений о целесообразности дальнейшего продвижения (go/no-go) на ранних стадиях доклинических исследований.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Данный метод вписывается в континуум открытий: от ранней валидации мишеней через разработку анализов до доклинических механистических исследований, что особенно актуально для программ по поиску биомаркеров в области неврологии и воспалительных процессов.
- Фундаментальная биология: способствует проверке гипотез и уточнению сигнальных путей, обеспечивая одновременное измерение нескольких белков слюны, связанных с патологическими состояниями.
- Скрининг: обеспечивает готовность анализа за счет стандартизированного кодирования микросфер, сборки волоконно-оптического массива и количественного определения на основе флуоресценции, совместимого с высококонтентным имиджингом.
- Аналитика: предоставляет количественные измерения зависимых переменных (интенсивность флуоресценции для каждого типа микросфер), что позволяет проводить сравнение между различными экспериментальными условиями и группами образцов.
- Трансляционные исследования: обеспечивают преемственность с доклиническим этапом за счет использования релевантных для заболевания слюнных биомаркеров, которые отражают системные или локальные патофизиологические процессы.
- Повторное использование в рамках организации: представляет собой адаптивную платформу на основе микросфер, применимую к различным сложным биологическим жидкостям, что способствует стандартизации между проектами и совместному использованию реагентов.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Повышает достоверность прогнозов при валидации мишеней за счет мультиплексного количественного определения белков в нативных биожидкостях.
- Операционная ценность: Повышает воспроизводимость и стандартизацию благодаря иммобилизации на волоконной оптике и алгоритмическому декодированию, что снижает уровень технических шумов.
- Стратегическая ценность: Повышает эффективность использования капитала за счет максимизации объема данных, получаемых из одного образца, и возможности повторного использования в рамках программ по поиску биомаркеров.
- Влияние на портфель: Обеспечивает приоритизацию с учетом рисков путем получения профилей нескольких аналитов, что позволяет принимать обоснованные решения относительно механизмов действия и безопасности.
Особенности реализации
- Для успешной постановки и оптимизации анализа требуются экспертные знания в области кодирования микросфер, конъюгации антител и флуоресцентной микроскопии.
- Сбор и декодирование сигнала зависят от наличия флуоресцентного микроскопа и инфраструктуры для анализа изображений на базе MATLAB.
- Для обеспечения воспроизводимости результатов в разных центрах необходима межкомандная стандартизация подготовки микросфер, работы с оптоволокном и протоколов анализа.
- Адаптация к другим модельным системам (например, сыворотке крови, моче) требует повторной валидации стабильности кодирования и эффективности антител в различных матрицах.
- Практические ограничения включают возможную утечку микросфер из микролунок и вариабельность сигнала из-за неполной промывки или испарения при сборке массива.
