Multiplexed Люминесцентная микрочипов для человека слюнных анализа белка с использованием полимерных микросфер и волоконно-оптических Связки
October 10th, 2013
Мы описываем процедуру для профилирования белки слюны, используя мультиплексированных массивы антител микросфер на основе. Моноклональные антитела ковалентно связаны с флуоресцентными красителями кодируется 4,5 мкм полимерных микросфер с использованием карбодиимида химии. Модифицированные микросферы были депонированы в волоконно-оптических лунки для измерения уровня белка в слюне с помощью сэндвич-флуоресценции иммунологические.
Общая цель этой процедуры заключается в анализе нескольких белков в образцах слюны человека с использованием флуоресцентных матриц на основе микросфер. Во-первых, закодируйте микросферы с помощью двух флуоресцентных красителей в разном количестве. Соедините антитела захвата для различных белков с закодированными микросферами.
Затем соберите мультиплексированный белковый микрочип на оптоволоконном пучке, используя сэндвич-иммунологические анализы на собранных микрочипах для нескольких белков в образцах тестовой слюны. В конечном счете, анализ с помощью флуоресцентной микроскопии может измерить сигнальные отклики различных белков в образцах слюны. Основное преимущество этого метода перед существующими методами, подобными методу Элизы, заключается в том, что он позволяет проводить одновременный анализ нескольких белков в сложных биожидкостях.
Хотя этот метод может дать представление об анализе слюны человека, он также может быть применен к другим биогриппам, таким как сыворотка мочи и мокрота. Взвесьте ТТА опиума во флаконе из янтарного стекла и приготовьте 200 миллимолярный исходный раствор в тетрагидро фурине. Аккуратно перемешайте с помощью пипетки и визуально убедитесь, что краситель полностью растворился.
Аналогичным образом приготовьте 12-миллимолярный стоковый раствор Кумарина 30, аккуратно перемешанный с помощью пипетирования. Зрительно. Убедитесь, что D полностью растворил вихрь в микросфере суспензии, а затем переложите 60 микролитров в микроцентрифугу объемом 1,5 миллитра. Чтобы промыть микросферы, добавьте 600 микролитров PBS, смешанных пипетированием 20 раз и центрифугируйте при 10 000 об/мин в течение трех минут.
После трех промываний раствором тетра гидрофурина удалите надосадочную жидкость, ресуспендируйте небо в 600 микролитрах рабочего раствора, и переложите смесь в новую микроцентрифугу объемом 1,5 миллитра. Запечатайте микроцентрифужную пробирку пара-пленкой и поместите ее на шейкер. Защитите его от света, накрыв алюминиевой фольгой.
Добавьте 200 микролитров закодированной микросферной суспензии в сейфовый замок, 1,5 миллилитровую микроцентрифужную пробирку. По каплям добавьте 150 микролитров свежеприготовленного раствора EDC Немедленно добавьте 150 микролитров сульфаниламидного раствора NHS. Хорошо перемешайте с помощью пипетирования и убедитесь, что суспензия однородна.
Закройте пробирку крышкой, запечатайте ее параформой и поставьте на шейкер. Защитите его от света, накрыв алюминиевой фольгой. После трех промывок буферной смеси P-B-S-S-D-S суспендируйте гранулу в 200 микролитрах буферной смеси P-B-S-S-D-S.
Ну а затем перелейте раствор в 300 микролитров буфера P-B-S-S-D-S, содержащего 60 микрограмм антител захвата. Смешайте по 50 микролитров каждого типа микросфер для захвата белка в новой автоклавной микроцентрифужной пробирке. Центрифугируйте стандартный бассейн микросфер при 7000 об/мин в течение трех минут и удалите все, кроме 100 микролитров надосадочной жидкости.
Теперь вручную вырежьте оптоволоконные пучки примерно до пяти сантиметров в длину, последовательно отполируйте оба конца с помощью алмазных притирочных пленок. Затем обработайте полированный пучок ультразвуком в деионизированной воде в течение двух минут. Чтобы удалить любые частицы, поместите небольшую магнитную мешалку в микроцентрифужную пробирку объемом 0,5 миллилитров.
Добавьте 400 микролитров буфера PBS без белка и перемешивайте на магнитной пластине для перемешивания в течение 30 минут. Чтобы удалить пузырьки воздуха, протравите один конец полированного пучка волокон в 0,025 обычного раствора хлористого водорода в течение 150 секунд. Немедленно погрузите и обработайте вытравленный N ультразвуком в деионизированной воде в течение одной минуты.
Затем высушите пучки волокон сжатым воздухом, установите пучок волокон на держатель волокна и заблокируйте протравленный конец в буфере PBS без пузыря без белка на один час, нанесите на протравленный конец оптоволоконного пучка квадрат ALI объемом в один микролитр хранящейся микросферной суспензии. Защитите установку от света коробкой, обернутой алюминиевой фольгой. Через 15 минут объем суспензии уменьшится за счет испарения и вытеснит микросферы в протравленные микролунки.
С помощью тампона, пропитанного раствором образца, удалите микросферы, которые не попали в микролунки. Чтобы сделать белковый микрочип готовым к использованию, добавьте 200 микролитров раствора образца в автоклавную микроцентрифугу объемом 0,5 миллилитра. Опустите в раствор белковый микрочип, загруженный на волокно, и поместите на шейкер.
Беречь от света, накрыв алюминиевой фольгой. Затем опустите белковый микрочип в новую автоклавную микроцентрифужную пробирку, содержащую 200 микролитров буфера для промывки, и встряхните при 600 оборотах в минуту в течение двух минут. Теперь инкубируйте микрочип в 100 микролитровом растворе коктейля антител для обнаружения, содержащего биотинилированные антитела для обнаружения и буфер для блокирования PBS в течение 30 минут.
При комнатной температуре в темное время суток очистите дистальный конец пучка волокон тампоном, пропитанным абсолютным этанолом. Затем высушите оба конца волокна сжатым воздухом, установите волокно на эпифлуоресцентный микроскоп и проведите изображение через дистальный конец волокна, получите микросферные изображения, соответствующие интенсивностям флуоресцентных излучений опия TTAC 30 и SAP. Здесь представлены кодирующие изображения семи типов микросфер.
В кодирующем изображении UTTA наблюдаются два уровня интенсивности, которые обозначают микросферы, закодированные разным количеством кристалла UTTA. Аналогичные результаты наблюдаются в изображении, кодирующем C 30. Анализ изображений с помощью MATLAB позволяет рассчитать интенсивности флуоресценции различных микросфер на сигнальном изображении. Результаты декодирования показаны на рисунке 2D семь.
Различные микросферы успешно расшифровываются. Микросферы не проявляют реакции при инкубации с буфером для анализа. При инкубации с образцами человеческой слюны наблюдаются значительные флуоресцентные реакции.
Для лучшего сравнения контрасты на этих двух рисунках были скорректированы до одного и того же уровня. После освоения этого метода можно проводить воспроизводимый анализ различных белков в образцах слюны человека. Показаны результаты трех независимых детектирований на одном и том же образце.
После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как приготовить мультиплексный белковый микролуч на основе микросферы и использовать его для сложного анализа биожидкостей. Следуя этой процедуре. Другие белковые биомаркеры в различных сложных биожидкостях также могут быть проанализированы.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Обзор
Эта статья описывает процедуру профилирования слюнных белков с использованием мультиплексированных анализов на основе микрошар. Метод позволяет одновременно анализировать несколько белков в образцах слюны человека, повышая возможности традиционных анализов.
Ключевые компоненты исследования
Область науки
- Нейронаука
- Биотехнология
- Протеомика
Фон
- Слюна содержит разнообразные белки, которые могут предоставить информацию о здоровье и болезнях.
- Традиционные методы, такие как ЭЛИСА, ограничены анализом одного белка за раз.
- Мультиплексированные анализы могут улучшить эффективность и богатство данных.
- Технология флуоресцентных микрошаров предлагает новый подход для обнаружения белков.
Цель исследования
- Разработать метод для анализа нескольких белков в слюне одновременно.
- Улучшить чувствительность и специфичность обнаружения белков в сложных биологических жидкостях.
- Предоставить более эффективную альтернативу существующим анализам на один анализируемый компонент.
Используемые методы
- Кодирование микрошаров флуоресцентными красителями.
- Ковалентная связь захватывающих антител с микрошарами.
- Сборка мультиплексированных протеиновых микрочипов на световодных оптоволоках.
- Использование флуоресцентных сэндвич-иммуноанализов для обнаружения белков в образцах слюны.
Основные результаты
- Метод успешно обнаружил несколько белков в образцах слюны.
- Флуоресцентная микроскопия обеспечила четкие сигналовые реакции для различных белков.
- Техника продемонстрировала преимущества перед традиционными методами ЭЛИСА.
- Результаты указывают на потенциальные применения в клинической диагностике.
Выводы
- Этот мультиплексированный подход позволяет эффективно анализировать слюнные белки.
- Метод может способствовать лучшему пониманию различных состояний здоровья.
- Будущие исследования могут расширить применение этой техники в других биологических жидкостях.
Часто задаваемые вопросы
Executive Industry Relevance
Multiplexed protein analysis in complex biofluids like saliva addresses a critical bottleneck in biomarker discovery, where traditional single-plex assays limit throughput and increase sample consumption. This microsphere-based fiber-optic array enables simultaneous quantification of multiple salivary proteins, improving assay efficiency and supporting early-stage target validation in neurodegenerative and inflammatory disease research. By providing quantitative, reproducible readouts from limited clinical samples, the method enhances predictive confidence in lead identification and preclinical de-risking workflows.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by measuring multiple salivary protein biomarkers simultaneously in disease-relevant samples.
- Operational Value: Reduces sample volume requirements and assay timelines through parallel protein detection in a single workflow.
- Predictive Value: Supports biomarker panel development and functional target validation by correlating multi-analyte responses with phenotypic outcomes.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates standardized, quantitative fluorescence readouts for six proteins using encoded microspheres, enabling reproducible assay performance across runs.
- Operational Value: Facilitates assay standardization via fiber-optic bundle immobilization and automated decoding algorithms, reducing user-dependent variability.
- Scalability: Supports platform reuse for other biofluids (serum, urine, sputum) as noted in the transcript, extending utility beyond saliva.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Bridges discovery and preclinical workflows by providing clinically relevant salivary protein data that can inform mechanistic models.
- Mechanistic De-risking: Enables pathway-level analysis through multiplexed detection, reducing ambiguity in target engagement and biological response assessments.
- Predictive Confidence: Delivers quantitative, fluorescence-based signal responses that support go/no-go decisions in early preclinical advancement.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from early target validation through assay development to preclinical mechanistic studies, particularly for biomarker-driven programs in neurology and inflammation.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by enabling simultaneous measurement of multiple salivary proteins linked to disease states.
- Screening: Delivers assay readiness through standardized microsphere encoding, fiber-optic array assembly, and fluorescence-based quantification compatible with high-content imaging.
- Analytics: Provides quantitative dependent variable measurements (fluorescence intensity per microsphere type) that allow comparison across experimental conditions and sample groups.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity via disease-relevant salivary biomarkers that reflect systemic or local pathophysiological processes.
- Enterprise Reuse: Encodes a adaptable microsphere-based platform applicable to multiple complex biofluids, supporting cross-project standardization and reagent sharing.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation through multiplexed, quantitative protein detection in native biofluids.
- Operational Value: Enhances reproducibility and standardization via fiber-optic immobilization and algorithmic decoding, reducing technical noise.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by maximizing data yield per sample and enabling reuse across biomarker programs.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by delivering multi-analyte profiles that inform mechanistic and safety-related decision-making.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microsphere encoding, antibody conjugation, and fluorescence microscopy for successful assay setup and optimization.
- Dependent on fluorescence microscopy and MATLAB-based image analysis infrastructure for signal acquisition and decoding.
- Necessitates cross-team standardization of microsphere preparation, fiber-optic handling, and assay protocols to ensure reproducibility across sites.
- Adaptation to other model systems (e.g., serum, urine) requires re-validation of encoding stability and antibody performance in differing matrices.
- Practical limitations include potential microsphere leakage from microwells and signal variability due to incomplete washing or evaporation during array assembly.
