Дитранол в качестве матрицы для матрицы лазерной десорбцией / ионизацией изображений на преобразования Фурье ионного циклотронного резонанса Масс-спектрометр

Данная процедура позволяет пространственно локализовать несколько эндогенных липидов в хрусталике быка. В работе используется метод масс-спектрометрической визуализации с применением матрично-активированной лазерной десорбции-ионизацией. Сначала подготавливают тонкий срез ткани хрусталика быка и наносят смешанную матрицу, затем получают набор данных масс-спектров MALDI.

Преобразуйте набор данных в визуальное представление обнаруженных липидов на срезе ткани хрусталика. Совокупность этих результатов позволяет определить локализацию и относительное содержание липидов в хрусталике быка и создать визуальную схему этого распределения. По сравнению с другими методами, такими как экстракция липидов с последующим анализом LCMS, масс-спектрометрическая визуализация MALDI позволяет одновременно визуализировать несколько липидов без потери их пространственной локализации. Извлеките образцы тканей, замороженные шоковым способом, из хранилища при температуре -80 °C.

Удалите капсулу с поверхности хрусталика для фиксации целого среза хрусталика теленка. Нанесите одну или две капли воды на стол для резки тканей криостата. Быстро поместите хрусталик в воду до того, как она затвердеет, после того как криостат достигнет оптимальной температуры.

Разрежьте ткань по экватору на срезы толщиной 20 микрон. Первые срезы ткани следует отбросить; для визуализации ткани хрусталика глаза используйте только те срезы, которые близки к экваториальной плоскости или проходят через нее. Нанесите 1,5 микронл муравьиной кислоты для предварительного увлажнения поверхности предметного стекла с ITO-покрытием.

Затем осторожно перенесите срезы ткани на предметное стекло внутри криостата. После этого подвергните предметные стекла лиофилизации в течение 15 минут перед нанесением матрицы MALDI. С помощью ручки-корректора нанесите три ориентирующие метки на непроводящую поверхность стекла с покрытием из ITO.

Теперь сделайте оптический снимок тканевого среза с помощью планшетного сканера и сохраните его в подходящем формате, например TIFF или jpeg. Сначала заклейте края передней поверхности предметных стекол с покрытием из ITO скотчем, чтобы матрица не покрывала края стекла. Подготовьте матрикс, растворив его в соответствующем растворителе.

Затем нанесите растворы матрицы на поверхность срезов ткани. Покройте предметное стекло, используя 20 циклов нанесения матрицы. В качестве альтернативы, если растворитель несовместим с электронным распылителем матрицы, для нанесения матриц можно использовать пневматический аэрозольный распылитель.

Для приготовления калибровочного раствора массы разбавьте стандартный раствор смеси для настройки ES в 200 раз в 60% Isopropanol; вводите разбавленный раствор смеси для настройки ES со скоростью 2 µL/мин в двухрежимный источник ионизации электрораспылением прибора FT-ICR MS. Используйте прибор FT-ICR в режиме положительных ионов ESI с широкополосным детектированием и объемом сбора данных 1024 кБ/с. Обычно параметры ESI устанавливают на значение 3900 В для напряжения капиллярного электрораспыления.

Установите напряжение защитного экрана распылителя на 3 600 вольт, поток азота в распылителе — на 2 л/мин. Поток сухого азота установите на 4 л/мин, а температуру — на 200 °C. Также установите напряжение скиммера 1 на 15 вольт.

Установите время пролета на 0,01 seconds, поток аргона в столкновительную ячейку на 0,4 liters per second, время накопления ионов в источнике на 0,1 second и время накопления ионов в столкновительной ячейке на 0,2 seconds. Теперь настройте рабочие параметры F-T-I-C-R для максимального повышения аналитической чувствительности в диапазоне отношений массы к заряду от 200 до 1400 при сохранении качественных сигналов затухания свободной индукции во временной области. Затем снимите масс-спектры методом ESI и откалибруйте прибор, используя референсные массы стандартных соединений в растворе калибровочной смеси E es.

Для настройки прибора для работы в режиме MALDI растворите несколько аликвот по 1 µL смешанного стандартного раствора турина и INE в растворе матрицы до концентрации 1 µM каждого вещества и нанесите эти растворы непосредственно на один из срезов ткани образца. Поместите предметное стекло в адаптер для тканевых срезов и вставьте адаптер со стороны MALDI в комбинированный источник ионов ESI/MALDI. Затем оптимизируйте соответствующие рабочие параметры MALDI, такие как мощность лазера и количество импульсов лазера для накопления MALDI-сигнала при каждом сканировании масс.

После настройки, калибровки и оптимизации прибора для экспериментов MALDI MSI совместите физическое положение среза ткани, предназначенного для визуализации, с его зарегистрированным оптическим изображением в программном обеспечении для визуализации. Совместите три метки из корректора, используя метод трехточечной триангуляции. Затем начните одновременную операцию ESI MALDI так, чтобы каждый масс-спектр содержал референсные пики масс раствора калибровочной смеси E ES для последующей внутренней калибровки масс.

Сначала ослабьте сигнал ESI, снижая напряжение на капилляре до тех пор, пока в спектрах не станут доминировать сигналы MALDI, при этом сигналы калибра ESI должны оставаться достаточно интенсивными для внутренней калибровки масс. Затем настройте автоматический метод сканирования лазерного излучения, используя анализ случайных точек.

Определите области ткани для визуализации и установите соответствующий размер шага РА лазера. Калибруйте масс-спектры MALDI с помощью внутренней калибровки для первоначального сравнения, а также для выбора пиков для MSMS деизотопирования и выбора моноизотопных пиков с помощью специализированного VBA-скрипта, после чего экспортируйте полученные списки моноизотопных пиков. Введите измеренные значения отношения массы к заряду в базы данных Melin nine и/или HMDB metabolome для сопоставления масс с записями в библиотеках.

Затем с помощью программного обеспечения для визуализации создайте MALDI-изображения для всех липидных компонентов, обнаруженных во всем срезе ткани, используя фильтр масс с шириной одной миллионной (1 ppm) на вершине пика. После того как будут созданы изображения для всех значений отношения массы к заряду, соответствующих записям в базе данных, создайте изображения и для всех остальных пиков, чтобы выявить уникальные паттерны распределения, которые можно будет изучить позже для некоторых специфических тканей, таких как хрусталик быка. При использовании метода монтажа с прямым размораживанием часто наблюдаются обширные разрывы ткани.

Предварительная обработка срезов IT OAS этанолом или муравьиной кислотой помогает сохранить целостность срезов ткани при их монтировании. Как выбор матрицы, так и выбор растворителя являются важными факторами, влияющими на качество MALDI-спектров. В данных примерах сравнивается спектр, полученный с использованием эффективного растворителя матрицы, со спектром, полученным при неудачном выборе растворителя матрицы для диола.

После получения набора масс-спектров в ходе эксперимента MALDI-MSI можно создать изображение для каждого из обнаруженных ионов. При этом каждый пиксель соответствует точке лазерного облучения поверхности среза ткани. Таким образом, можно детально определить относительную концентрацию аналитов в различных областях среза ткани.

В большинстве экспериментов данные нормализуются по общему току ионов в каждом спектре. Без такой нормализации области с более подходящей матрицей аналитов или кристаллизацией COC могли бы давать более сильные сигналы аналитов, что привело бы к искажению данных. Подготовка тканей также может существенно изменить получаемое изображение.

Если образец слишком влажный, аналиты будут делокализоваться в ткани, и большая часть пространственной информации будет утрачена. В данной демонстрации эксперимента по визуализации ткани хрусталика глаза использовался диол в качестве мультиматрицы для определения пространственного распределения липидов методом F-T-I-C-R-M-S. Визуализация липидов в различных типах тканей может быть осуществлена аналогичным образом с использованием диола или другой матрицы.