Дитранол в качестве матрицы для матрицы лазерной десорбцией / ионизацией изображений на преобразования Фурье ионного циклотронного резонанса Масс-спектрометр

Эта процедура пространственно локализует множественные эндогенные липиды в хрусталике крупного рогатого скота. Использование метода матричного лазера ДЕСОРБЦИЯ ионизации, масс-спектрометрическая визуализация. Сначала подготовьте тонкий срез ткани бычьего хрусталика и нанесите мультиматрицу, а затем получите масс-спектральный набор данных maldi.

Оформите набор данных в визуальное представление обнаруженных липидов на участке ткани хрусталика. По сравнению с другими методами, такими как экстракция липидов с последующим анализом LCMS, масс-спектрометрическая визуализация позволяет визуализировать несколько липидов одновременно без потери их пространственной локализации. Извлеките образцы тканей из хранилища при температуре минус 80 градусов Цельсия.

Снимите капсулу с поверхности хрусталика, чтобы зафиксировать целую секцию хрусталика бычьего теленка. Поместите одну или две капли воды на этап разрезания тканей криостата. Быстро поместите линзу в воду, пока она не застыла, когда криостат уравновесится до оптимальной температуры.

Разрежьте ткань в горизонтальном направлении на участки толщиной 20 микрон. Откажитесь от первых участков ткани и используйте только те срезы, которые находятся близко к экваториальной плоскости или добавляют ее для визуализации ткани глазного хрусталика. Добавьте 1,5 микролитра муравьиной кислоты, чтобы предварительно намочить поверхность предметного стекла с покрытием ITO.

Затем аккуратно перенесите срезы ткани на предметное стекло внутрь криостата. Далее лиофилизируйте слайды в течение 15 минут перед нанесением матрицы maldi. С помощью корректирующего флюидного пера добавьте три обучающие метки на непроводящей поверхности предметного стекла с покрытием ITO.

Теперь сделайте оптическое изображение предметного стекла с помощью планшетного сканера и сохраните его в соответствующем формате, таком как TIFF или jpeg. Сначала заклейте края на лицевой поверхности стеклянных предметных стекол с покрытием ITO скотчем, чтобы матрица не покрывала края предметного стекла. Подготовьте матрицу для использования в соответствующем растворителе.

Затем нанесите матричные растворы на поверхности участков тканей. Нанесите покрытие на предметное стекло с помощью 20 циклов матричного покрытия. В качестве альтернативы, для нанесения матриц можно использовать пневматический распылитель, если растворитель несовместим с электронным матричным распылителем.

Для решения для калибровки массы разбавьте стандартный раствор смеси для настройки ES в один к 200 раз в 60%Изопропанол вводится два микролитра в минуту разбавленного раствора смеси для настройки ES в двухрежимный источник ионизации с электронным распылением на приборе в течение четырех мс. Работа прибора F-T-I-C-R в режиме положительного ионного ESI с широкополосным детектированием и размером сбора данных 1024 килобайта в секунду. Обычно устанавливаются параметры ESI на уровне 3 900 вольт капиллярного электроспрея.

Распылительный щиток напряжением 3,600 вольт небулайзера расходует азот со скоростью два литра в минуту. Сухой газообразный поток азота со скоростью четыре литра в минуту и температурой 200 градусов по Цельсию. Также установите скиммер на одно напряжение на 15 вольт.

Время пролета до 0,01 секунды Столкновение потока газообразного аргона до 0,4 л в секунду Время накопления ионов источника до 0,1 секунды и время накопления ионов ячейки столкновения до 0,2 секунды. Теперь настройте рабочие параметры F-T-I-C-R, чтобы максимизировать аналитическую чувствительность в диапазоне масс от массы к отношению заряда от 200 до 1400 при сохранении хороших сигналов затухания индукции во временной области. Затем получите масс-спектры ESI и откалибруйте прибор с использованием эталонных масс стандартных соединений в растворе смеси для настройки Ees.

Для настройки прибора на работу с MALDI необходимо растворить в матричном растворе несколько аликвот по одному микролитру смешанного раствора турина и стандартного раствора INE в концентрации по одному микромоляру каждая и нанести эти растворы непосредственно на один из участков ткани образца. Поместите предметное стекло в адаптер для тканевых предметных стекол и загрузите адаптер со стороны MALDI в двойной источник ионов ESI maldi. Затем оптимизируйте соответствующие рабочие параметры MALDI для мощности лазера и количество лазерных выстрелов для накопления сигнала MALDI для каждого массового сканирования.

После настройки, калибровки и оптимизации прибора для экспериментов maldi MSI сопоставьте физическое местоположение участка ткани, подлежащего визуализации, с его записанным оптическим изображением в программном обеспечении для визуализации. Совместите три корректирующие маркировки жидкости с помощью метода трехточечной триангуляции. Затем начните одновременную операцию ESI MALDI, чтобы каждый масс-спектр содержал эталонные пики массы решения для настройки смеси E ES для внутренней калибровки массы после сбора данных.

Сначала ослабьте сигнал ESI, уменьшая капиллярное напряжение до тех пор, пока сигналы MALDI не будут доминировать в спектрах, в то время как сигналы калибра ESI все еще будут достаточно высоки для внутренней калибровки массы. Далее настраиваем автоматизированный метод расстановки лазера излучения. Использование анализа случайных пятен.

Определите участки тканей для визуализации и установите соответствующий размер шага лазерного РА. Откалибруйте масс-спектры MALDI с помощью внутренней калибровки для первоначального сравнения, а также выберите пики для изотопа MSMS de и выберите моноизотопные пики с помощью настраиваемого скрипта VBA и экспортируйте полученные списки моноизотопных пиков. Введите измеренные значения отношения массы к заряду в базы данных метаболомов Melin nine и HMDB для сопоставления массы с записями библиотеки.

Затем сгенерируйте изображения maldi для всех липидных образований, обнаруженных на всем участке ткани, с помощью программного обеспечения для визуализации с шириной фильтра массы одна часть на миллион в пиковой вершине. После того, как изображения были сгенерированы для всех значений отношения массы к заряду, которые соответствуют записям базы данных, генерируются изображения и для всех других пиков, чтобы искать уникальные закономерности распределения, которые могут быть исследованы позже для некоторых конкретных тканей, таких как бычий хрусталик. Обширный разрыв ткани часто наблюдается при использовании прямого монтажа для оттаивания.

Предварительное покрытие предметного стекла IT OAS с этанолом или муравьиной кислотой помогает сохранить целостность участков ткани во время монтажа ткани. Как выбор матрицы, так и выбор растворителя являются важными факторами, влияющими на качество спектров MALDI. В этих примерах сравнивается спектр, полученный с помощью эффективного матричного растворителя, с плохим выбором матричного растворителя для диола.

После того, как набор масс-спектров из эксперимента Maldi MSI был получен, можно получить изображение для каждого из обнаруженных ионов. Каждый пиксель представляет собой пятно лазерного излучения с поверхности участка ткани. Относительные концентрации аналитов могут быть подробно описаны в различных частях тканевого среза.

В большинстве экспериментов данные нормализуются по общему ионному току в каждом спектре. Без этой нормировки областей с лучшей аналитной матрицей кристаллизация COC может вызвать более сильные сигналы для аналитов, и это исказит данные. Препарирование тканей также может кардинально изменить создаваемое изображение.

Если образец слишком влажный, то аналиты будут делокализоваться на ткани, и большая часть пространственной информации будет потеряна. В этой демонстрации эксперимента по визуализации тканей на глазном хрусталике использовался диол в качестве мультиматрицы для определения пространственного распределения липидов по F-T-I-C-R-M-S. Визуализация липидов в различных типах тканей может быть выполнена с помощью диола или другой матрицы аналогичным образом.