Кишечные бактериальной инвазии эпителиальных клеток кишечника

Общая цель следующего эксперимента заключается в использовании модели камеры вертикальной диффузии (VDC) для исследования взаимодействия бактерий с эпителиальными клетками кишечника при их инвазии. Сначала для создания раздельных апикального и базолатерального отделений в VDC используется специальный фильтр, на котором сформирован поляризованный монослой эпителиальных клеток кишечника Caco-2. На втором этапе в апикальное отделение добавляют интересующий бактериальный инокулят.

В условиях микроаэробного культивирования клеток в базалатеральный отдел в аэробных условиях добавляют среду, затем в определенные моменты времени в процессе совместного культивирования фильтр извлекают и подсчитывают количество взаимодействующих или внутриклеточных бактерий. В конечном итоге при использовании модели VDC может наблюдаться увеличение числа взаимодействующих и внутриклеточных бактерий по сравнению со стандартными условиями аэробного культивирования. Основное преимущество данного метода перед существующими, такими как стандартные тесты на адгезию и инвазию в культурах тканей, заключается в том, что совместное культивирование бактерий и эпителиальных клеток кишечника проводится в условиях in vitro, которые более точно имитируют условия in vivo в кишечнике человека.

Процедуру продемонстрируют Н. Вида Нас, аспирантка моей лаборатории, и Доминик Миллс, постдок, который разработал модель камеры вертикальной диффузии в рамках своей докторской диссертации в моей лаборатории. Начните с высева 4×10⁵ клеток кишечного эпителия Caco-2 на фильтр с порами 0,4 мкм в культуральной среде, затем культивируйте клетки до достижения поляризации в течение 21 дня, меняя среду каждые два-три дня для подтверждения статуса поляризации монослоя. Используйте вольт-омметр для измерения трансэпителиального электрического сопротивления.

За 24 часа до начала анализа совместного культивирования в VDC инкубируйте jejuni на свежем кровяном агаре в микроаэробных условиях в инкубаторе с регулируемым составом газовой среды. Одновременно с этим предварительно инкубируйте 30 миллилитров бульона Брюса в тех же условиях. В день эксперимента погрузите половины камер VDC, а также уплотнительные кольца и пробки в стерилизующий раствор. Затем с помощью стерильного шприца объемом 20 миллилитров промойте раствор через газовые впуски в обеих половинах камер. Через час промойте компоненты VDC свежей стерильной водой, используя другой стерильный шприц объемом 20 миллилитров для промывки газовых впусков.

Затем перенесите половину культуры с чашки с кровяным агаром CJ в 1 мл предварительно инкубированного бульона Barella, чтобы получить примерно 10¹⁰ КОЕ на мл. Измерьте оптическую плотность бактериальной суспензии при 600 нм для полуколичественного определения количества бактериальных колониеобразующих единиц (КОЕ), а затем доведите бактериальную суспензию до нужного уровня инокулята в общем объеме 4 мл предварительно инкубированного бульона Брюса. Выполните серийное разведение этой итоговой бактериальной суспензии, затем высейте соответствующее разведение на чашки с кровяным агаром в трех повторностях и инкубируйте чашки в инкубаторе с регулируемым составом атмосферы в течение 48 часов.

Теперь положите нижнюю часть камеры VDC на стол и установите на нее уплотнительное кольцо. Затем отсоедините один фильтр с клетками кишечного эпителия от держателя и трижды промойте его 400 µL стерильного PBS. Поместите фильтр в нижнюю часть камеры, убедившись, что уплотнительное кольцо осталось на месте, а затем осторожно установите сверху верхнюю часть камеры.

После сборки двух половин камер зафиксируйте их вместе с помощью кольцевых зажимов и расположите VDC горизонтально на лабораторном столе двумя отверстиями вверх. Внесите бактериальный инокулят в апикальную половину камеры, а затем добавьте четыре миллилитра среды для культивирования клеток в базальную латеральную половину камеры. Установите торцевые заглушки в отверстия обеих половин камер, после чего поместите VDC в инкубатор с регулируемым составом атмосферы.

Рядом с газовым коллектором откройте регулятор подачи газа, подключенный к коллектору. Подсоедините трубку от коллектора к газовому входу в нижней боковой полукамере VDC, а затем подсоедините трубку газового выхода, ведущую из инкубатора с регулируемой атмосферой, к одному из выходов в концевом элементе нижней боковой полукамеры. Перекройте другой выход в концевом элементе нижней боковой полукамеры.

Затем очень медленно откройте подачу газа на газовом коллекторе, чтобы избежать избыточного давления и обеспечить скорость потока газа в один пузырек каждые две-пять секунд по истечении соответствующего периода совместного культивирования. Закройте регулятор подачи газа, подключенный к газовому коллектору. Затем сбросьте поток газа из VDC на коллекторе и отсоедините вход для газа, выход для газа и пробку от VDC.

Затем извлеките VDC из инкубатора с регулируемым составом атмосферы. Соберите супернатанты из апикальной и базальной латеральных камер и храните их при температуре -80 °C для последующего анализа. Снимите кольцевые зажимы и аккуратно разберите VDC.

Извлеките фильтр из полукамеры и перенесите его в стерильный 6-луночный планшет для культивирования клеток. Затем промойте VDC стерильной водой и сохраните для следующего этапа экспериментов по подсчету общего числа взаимодействующих бактерий. Промойте эпителиальные клетки кишечника трижды 400 µL стерильного PBS, после чего лизируйте их в 400 µL стерильного PBS, содержащего Triton X 100, в течение 20 минут при комнатной температуре; проведите серийное разведение клеточного лизата с последующим высевом соответствующих разведений на чашки с кровяным агаром в трех повторностях.

Затем инкубируйте чашки при 37 °C в инкубаторе с регулируемой атмосферой в течение 48 часов для подсчета общего количества инвазивных бактерий. Инкубируйте эпителиальные клетки кишечника с 400 µL культуральной среды, содержащей 150 µg/mL гентамицина, в течение двух часов в стандартном инкубаторе для культур тканей, чтобы уничтожить внеклеточные бактерии. Затем определите количество колониеобразующих единиц после лизиса клеток, серийного разведения и культивирования, как было продемонстрировано выше.

Следующие данные иллюстрируют сравнение количества *C. jejuni*, взаимодействующих с клетками Caco 2 или проникающих в них, через три, шесть или 24 часа совместного культивирования в стандартных условиях клеточного анализа по сравнению с использованием модели VDC. Например, через 24 часа совместного культивирования в стандартных условиях клеточного анализа наблюдается взаимодействие менее 10⁷ КОЕ *C. jejuni* с клетками Caco 2. Однако через 24 часа совместного культивирования в модели VDC наблюдается взаимодействие примерно 10⁸ КОЕ *C. jejuni* с клетками Caco 2, что представляет собой почти десятикратное увеличение взаимодействий *C. jejuni* с кишечными эпителиальными клетками.

При сравнении количества проникающих CJ jui в стандартных условиях культивирования и в условиях VDC, через 24 часа стандартного культивирования клеток из CACO two может быть выделено примерно 10⁵ внутриклеточных КОЕ CGE jui. В то время как после 24 часов совместного культивирования в модели VDC из клеток CACO two может быть выделено примерно 10⁷ внутриклеточных КОЕ, что соответствует увеличению количества внутриклеточных CGE почти в 100 раз. При выполнении данной процедуры важно контролировать поток газа в базально-латеральной камере после ее формирования.

Этот метод открыл исследователям в области патогенеза abuc возможность изучить как генетические основы взаимодействия бактерий с эпителиальными клетками кишечника, так и врожденный иммунный ответ хозяина на бактериальную инфекцию. После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как использовать модель камеры вертикальной диффузии для изучения взаимодействия других кишечных бактерий с эпителиальными клетками кишечника в условиях, которые максимально приближены к условиям в кишечнике человека.