Выделение микрососудистой эндотелиальных трубок от сопротивления мышь автомагистралях

Общая цель этой процедуры заключается в выделении эндотелиальных клеточных трубок из верхней эпигастральной артерии мыши или СЭО для изучения внутри- и межклеточной сигнальной динамики нативного интактного микрососудистого эндотелия. Это достигается путем выделения СЭО от стенки скелетных мышц живота мыши. На втором этапе сосуд мягко и соматически переваривается, а затем тщательно TAT для диссоциации гладкомышечных клеток и адвентиции из эндотелиальной клеточной трубки.

На заключительном этапе трубка закрепляется в проточной камере и суперсплавляется физиологическим раствором. В конечном счете, конфокальная визуализация может быть использована для визуализации передачи сигналов кальция в нативной интактной микрососудистой эндотелиальной трубке. Основное преимущество этого метода перед существующими методами, такими как культивирование эндотелиальных клеток, заключается в том, что эндотелиальные клетки, которые составляют трубку и поддерживают свою естественную морфологию, экспрессию белков и реакцию, эндотелий является неотъемлемой частью контроля кровотока по всему организму.

Применение этого метода позволяет нам исследовать межклеточные сигнальные события, которые опосредуют контроль кровотока, и то, как они могут идти наперекосяк во время сосудистой дисфункции. Чтобы изолировать СЭО, сначала сделайте небольшой разрез через кожу чуть выше области лобковой области мыши, находящейся под наркозом, продлите разрез латерально в каждом направлении до соответствующих задних конечностей, а затем продолжайте разрез вдоль вентральной средней линии до верхней части грудной клетки, далее расширяя разрез латерально в каждом направлении до соответствующих четырех конечностей. Теперь аккуратно поднимите кожу и разрежьте соединительную ткань, удерживающую кожу к нижележащей мышце, обнажив всю поверхность брюшной мускулатуры.

Орошите обнаженную мышцу солевым раствором комнатной температуры. Затем под стереомикроскопом приподнимите жировую подушку, расположенную в нижней части грудины. Сделайте надрез через жировую подушку и вдоль нижнего ребра.

Теперь СЭО должно быть видно, стараясь не повредить артерию, орошайте открытые ткани более комнатной температурой, солевым раствором. После того, как верхний слой скелетных мышц будет втянут, обратите внимание на длину SEA, а затем осторожно иссеките тонкий мышечный слой под артерией. Затем с помощью наклонных щипцов проденьте шелковый шов длиной шесть х х под SCA.

Затем перевяжите артерию и прилегающую к ней вену, чтобы поддерживать давление в ней и удерживать кровь в просвете сосуда. После перевязки SCA на контралатеральной стороне сделайте разрез по средней линии мышц живота, чтобы разделить соответствующие стороны, а затем продлите разрез в поперечном направлении в каждом направлении, как это делается для кожи. Продолжайте разрез вертикально по внешнему краю, чтобы полностью отделить мышцу живота от тела.

Затем разрежьте SEA над лигацией, чтобы сохранить уплотнение, и поместите изолированную мышцу и артерию в стакан объемом 50 миллилитров, содержащий 10 миллилитров буфера для рассечения четырех градусов Цельсия. После выделения мышцы с другой стороны брюшной полости инкубируйте ткани в буфере для рассечения в течение 10 минут. Теперь поместите мышцы живота, содержащие СЭО, в чашку Петри с температурой 4 градусов Цельсия, покрытую слоем цилиндрической защиты и содержащую буфер для рассечения

Закрепите SEA на защитном кожухе, ориентируя мышцу таким образом, чтобы тонкий слой, обращенный к брюшине, был сверху. Затем, работая от восходящего участка лигирования к нижнему концу, очищайте примерно один-два сантиметра SEA от его парной вены и окружающих тканей до первого крупного участка ветви. Разрежьте SEA чуть выше места ветви и чуть ниже лигирования.

Затем используйте кусок эластичной трубки, чтобы прикрепить заднюю часть пипетки к пятимиллилитровому шприцу, содержащему буфер для ледяного препарирования. Закрепите наконечник канюляционной пипетки в камере для вскрытия и канюлируйте SEA. Затем, когда все эритроциты будут вымыты, удалите SEA из канюляционной пипетки и извлеките пипетку из диссекционной чашки, чтобы изолировать эндотелиальные трубки.

Сначала заполните стеклянную пробирку для культуры размером 12 на 75 мм наполовину ледяным буфером для вскрытия. Затем, разрезав СЭО на кусочки от одного до трех миллиметров, с помощью угловых щипцов перенесите артериальные фрагменты в культуральную трубку и поместите трубку на лед. Затем соедините ферменты разложения с буфером диссоциации до конечного объема один миллилитр в отдельной пробирке для культивирования размером 12 на 75 миллиметров и предварительно нагрейте раствор фермента до 37 градусов Цельсия с помощью нагревательного блока.

Извлеките культуральную пробирку, содержащую артериальные фрагменты, от четырех градусов Цельсия и поместите ее при комнатной температуре, чтобы она нагрелась, пока раствор фермента нагревается до 37 градусов Цельсия. Осторожно отасуньте теперь уже комнатную температуру буфера для рассечения из питательной пробирки, оставив небольшой объем, содержащий сегменты сосуда. Теперь медленно добавьте диссоциативный буфер комнатной температуры без ферментов в сегменты сосудов таким образом, чтобы артериальные фрагменты оставались на дне пробирки для культивирования, чтобы смыть любые оставшиеся буферы для расслоения.

Как только температура ферментного раствора достигнет 37 градусов Цельсия, снова отсадите буфер диссоциации из питательной пробирки, содержащей сегменты сосуда, оставив небольшой объем, содержащий сегменты сосуда. Теперь перенесите 37-градусный ферментный раствор в культуральную пробирку и инкубируйте культуральную пробирку в нагревательном блоке в течение 30 минут при температуре 37 градусов Цельсия. Во время инкубации подготовьте литерирующую пипетку, заполненную минеральным маслом, надрежьте пипетку, сделайте чистый разлом, разбейте пипетку с помощью пламенных клещей, отполируйте кончик пипетки и закрепите его на микрошприце, установленном в микроманипуляторе.

Затем втяните поршень микрошприца, чтобы заполнить пипетку двумя нанолитрами диссоциативного буфера, и расположите наконечник пипетки над проточной камерой в конце инкубации. После тщательной аспирации буфера, как показано выше, промойте артериальные сегменты четырьмя миллилитрами диссоциационного буфера комнатной температуры. Затем аккуратно отасуньте один сегмент сосуда с помощью микропипетки объемом в один миллилитр и поместите сосуд в проточную камеру с одним миллилитром буфера диссоциации.

Расположите кончик пипетки для таирования рядом с одним концом сегмента сосуда, а затем аспирируйте сегмент сосуда в пипетку для таирования со скоростью около 225 нанолитров в секунду, чтобы не вызвать механической нагрузки на эндотелиальные клетки, выбросьте сосуд обратно в камеру. Если пищеварение прошло успешно, гладкомышечные клетки и адвентиция будут диссоциированы от эндотелиальной трубки. Как можно скорее отодвиньте адвентицию от эндотелиальной трубки, чтобы она не запуталась в трубе, а затем повторяйте процедуру, как показано только что до тех пор, пока все гладкомышечные клетки не будут диссоциированы.

После заключительной итерации ASEE поместил изолированную эндотелиальную трубку в центр проточной камеры, выровнял по направлению потока и удалил запускающую пипетку. Закрепите штифтовые пипетки в микроманипуляторах, установленных на обоих концах проточной камеры, а затем расположите их наконечники на соответствующих концах эндотелиальной трубки. Опускайте пипетки с булавками по одной на противоположные концы пробирки, прижимая пробирку к дну камеры, примерно в 50 микрометрах от каждого конца пробирки.

Как только пипетка для штифтинга коснется трубки, медленно втяните ее вдоль оси трубки, удлинив ее до приблизительной длины in vivo. Прижмите пипетку к дну камеры, чтобы зафиксировать трубку, а затем начните поток суперфузионного раствора с помощью перистальтического насоса для поддержания постоянного потока суперфузионного раствора через эндотелиальную трубку. На этом дифференциально-интерференционно-контрастном изображении показана изолированная эндотелиальная клеточная трубка из СЭО, которая следует за одночасовым суперфузионным буфером со скоростью три миллилитра в минуту при комнатной температуре.

В этом фильме демонстрируется реакция кальция на эндотелиальную клеточную трубку с четырьмя нагрузками гриппа в ответ на стимуляцию ацетилхолином в один микромоль. Эти репрезентативные флуоресцентные изображения были собраны в различные моменты времени после стимуляции эндотелиальной трубки ацетилхолином. Обратите внимание, как внутриклеточный кальций колеблется с течением времени.

Пытаясь выполнить эту процедуру, важно помнить о том, что следует избегать механического повреждения эндотелиальной трубки во время тройного позиционирования и штифтинга, так как эндотелиальные клетки чрезвычайно хрупкие и легко повреждаются. После просмотра этого видео вы должны иметь хорошее представление о том, как изолировать эндотелиальные трубки от верхней эпигастральной артерии мыши, и тем самым изучить нативный интактный микрососудистый эндотелий.