Выделение микрососудистой эндотелиальных трубок от сопротивления мышь автомагистралях

Общая цель данной процедуры заключается в выделении трубок эндотелиальных клеток из верхней эпигастральной артерии (SEA) мыши для изучения внутри- и межклеточной динамики сигнальных путей нативного интактного микрососудистого эндотелия. Сначала SEA выделяют из стенки брюшных скелетных мышц мыши. На втором этапе сосуд подвергают бережному соматическому перевариванию, после чего аккуратно проводят тритурацию (TATing) для отделения гладкомышечных клеток и адвентиции от трубки эндотелиальных клеток.

На заключительном этапе пробирку закрепляют в проточной камере и перфузируют физиологическим раствором. В конечном итоге можно использовать конфокальную микроскопию для визуализации кальциевой сигнализации в нативном интактном микрососудистом эндотелиальном трубчатом сооружении. Основным преимуществом данного метода по сравнению с существующими способами, такими как культивирование эндотелиальных клеток, является то, что эндотелиальные клетки, составляющие трубку, сохраняют свою нативную морфологию, экспрессию белков и функциональный ответ. Эндотелий играет неотъемлемую роль в регуляции кровотока во всем организме.

Применение данного метода позволяет нам исследовать события межклеточной сигнализации, которые опосредуют контроль кровотока, и выяснить, как они могут нарушаться при сосудистой дисфункции. Чтобы выделить SEA, сначала сделайте небольшой разрез кожи чуть выше лобковой области у анестезированной мыши, расширьте разрез латерально в обоих направлениях до соответствующих задних конечностей, затем продолжайте разрез вдоль вентральной срединной линии до верхней части грудной клетки, дополнительно расширив разрез латерально в обоих направлениях до соответствующих четырех конечностей. Теперь аккуратно приподнимите кожу и рассеките соединительную ткань, удерживающую кожу на подлежащих мышцах, обнажая всю поверхность брюшной мускулатуры.

Промойте обнаженную мышцу физиологическим раствором комнатной температуры. Затем под стереомикроскопом приподнимите жировую подушку, расположенную в нижней части грудины. Сделайте разрез через жировую подушку вдоль нижнего ребра.

Теперь должна стать видимой SEA; стараясь не повредить артерию, промойте обнаженные ткани физиологическим раствором комнатной температуры. После ретракции верхнего слоя скелетной мускулатуры отметьте длину SEA, а затем осторожно иссеките тонкий слой мышц под артерией. Далее с помощью изогнутого пинцета проведите шелковую нить 6-0 под SCA.

Затем перевяжите артерию и прилегающую к ней вену, чтобы сохранить давление и предотвратить вытекание крови из просвета сосуда. После перевязки SCA на противоположной стороне сделайте разрез по срединной линии мышц брюшной стенки, чтобы разделить соответствующие стороны, а затем продлите разрез латерально в обоих направлениях, как это было сделано с кожей. Продолжите разрез вертикально вдоль внешнего края, чтобы полностью отделить мышцы брюшной стенки от тела.

Затем разрежьте SEA выше места лигирования, чтобы сохранить герметичность, и поместите изолированную мышцу и артерию в стакан объемом 50 milliliter, содержащий 10 milliliters диссекционного буфера при температуре four degrees Celsius. После изолирования мышцы с другой стороны брюшной полости инкубируйте ткани в диссекционном буфере в течение 10 minutes. Теперь поместите брюшную мышцу с SEA в чашку Петри при температуре four degree Celsius, покрытую слоем cyl guard и содержащую диссекционный буфер. Используйте энтомологические булавки диаметром 0.15 millimeter, чтобы растянуть SEA и мышцу до их приблизительной длины in vivo, отмеченной ранее.

Закрепите SEA на фиксаторе цилиндра, расположив мышцу таким образом, чтобы тонкий слой, обращенный к брюшине, находился сверху. Затем, двигаясь от проксимального места лигирования к дистальному концу, отделите около 1–2 см SEA от парной вены и окружающих тканей до первого крупного разветвления. Перережьте SEA непосредственно над местом разветвления и непосредственно под местом лигирования.

Затем с помощью отрезка эластичной трубки прикрепите заднюю часть пипетки к шприцу объемом 5 мл, содержащему ледяной буфер для диссекции. Закрепите кончик канюлирующей пипетки в камере для диссекции и проведите канюляцию SEA. После того как все эритроциты будут вымыты, извлеките SEA из канюлирующей пипетки, а затем извлеките саму пипетку из чашки для диссекции, чтобы изолировать эндотелиальные трубки.

Сначала наполните стеклянную культуральную пробирку размером 12 × 75 мм наполовину ледяным буфером для диссекции. Затем, разрезав SEA на фрагменты размером от 1 до 3 мм, с помощью углового пинцета перенесите фрагменты артерий в культуральную пробирку и поместите ее на лед. Далее смешайте пищеварительные ферменты с буфером для диссоциации до конечного объема 1 мл в отдельной культуральной пробирке размером 12 × 75 мм и предварительно нагрейте раствор ферментов до 37 °C с помощью термоблока.

Извлеките пробирку с фрагментами артерий из среды с температурой 4 °C и оставьте ее при комнатной температуре для прогрева, пока раствор фермента нагревается до 37 °C. Осторожно аспирируйте буфер для диссекции, достигший комнатной температуры, из пробирки, оставив небольшой объем жидкости, в котором находятся сегменты сосудов. Затем медленно добавьте буфер для диссоциации без ферментов комнатной температуры к сегментам сосудов так, чтобы фрагменты артерий оставались на дне пробирки, для вымывания остатков буфера для диссекции.

Когда раствор фермента достигнет 37 °C, снова аспирируйте буфер для диссоциации из культуральной пробирки с сегментами сосудов, оставив небольшой объем жидкости, в котором находятся сегменты сосудов. Теперь перенесите раствор фермента при 37 °C в культуральную пробирку и инкубируйте ее в нагревательном блоке в течение 30 минут при 37 °C. Во время инкубации подготовьте литрационную пипетку, заполненную минеральным маслом: сделайте надрез на пипетке, аккуратно отломите кончик, обожгите край пипетки щипцами, отполируйте кончик пипетки и закрепите ее на микрошприце, установленном в микроманипуляторе.

Затем отведите поршень микрошприца, чтобы наполнить пипетку двумя нанолитрами буфера для диссоциации, и расположите кончик пипетки над проточной камерой по окончании инкубации. После осторожного аспирирования буфера, как было показано выше, промойте сегменты артерий четырьмя миллилитрами буфера для диссоциации комнатной температуры. Затем аккуратно аспирируйте один сегмент сосуда с помощью микропипетки объемом один миллилитр и поместите сосуд в проточную камеру с одним миллилитром буфера для диссоциации.

Расположите кончик тритационной пипетки рядом с одним из концов сегмента сосуда, затем втяните сегмент в пипетку со скоростью примерно 225 нанолитров в секунду, чтобы не вызвать механического повреждения эндотелиальных клеток, и вытолкните сосуд обратно в камеру. Если дигестия прошла успешно, гладкомышечные клетки и адвентиция отделятся от эндотелиальной трубки. Как можно скорее удалите адвентицию от эндотелиальной трубки, чтобы она не запутала её, и затем повторяйте тритацию, как было продемонстрировано, до полной диссоциации всех гладкомышечных клеток.

После завершения последней итерации поместите изолированную эндотелиальную трубку в центр поточной камеры, ориентировав её вдоль направления потока, и извлеките триггерную пипетку. Закрепите фиксирующие пипетки в микроманипуляторах, установленных по обоим концам поточной камеры, а затем расположите их кончики у соответствующих концов эндотелиальной трубки. Поочередно опустите фиксирующие пипетки на противоположные концы трубки, прижимая трубку к дну камеры примерно в 50 micrometers от каждого ее конца.

Как только фиксирующая пипетка коснется трубки, медленно вытяните ее вдоль оси трубки, растягивая до приблизительной длины in vivo. Прижмите пипетку к дну камеры, чтобы закрепить трубку, а затем запустите поток суперфузионного раствора с помощью перистальтического насоса для поддержания постоянного тока раствора через эндотелиальную трубку. На данном изображении, полученном методом дифференциально-интерференционного контраста, показана изолированная эндотелиальная клеточная трубка из SEA после одного часа суперфузии буфером со скоростью 3 mL/min при комнатной температуре.

В данном видео продемонстрированы кальциевые ответы эндотелиальной трубки, нагруженной fluo-4, в ответ на стимуляцию 1 µM ацетилхолином. Эти репрезентативные изображения флуоресценции были получены в различные моменты времени после стимуляции эндотелиальной трубки ацетилхолином. Обратите внимание на то, как концентрация внутриклеточного кальция осциллирует с течением времени.

При выполнении данной процедуры важно помнить о необходимости избегать механического повреждения эндотелиальной трубки во время ее позиционирования и закрепления булавками, так как эндотелиальные клетки крайне хрупки и легко повреждаются. После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как изолировать эндотелиальные трубки из верхней эпигастральной артерии мыши и таким образом изучать нативный интактный микрососудистый эндотелий.