Модель in vitro для изучения иммунных реакций мононуклеарных клеток периферической крови человека на респираторно-синцитиальную вирусную инфекцию человека

Общая цель данной процедуры заключается в изучении реакции иммунных клеток человека на инфекцию респираторного синцитиального вируса (RSV). Это достигается путем первоначального культивирования инфекционного стока RSV на клетках HeLa. На втором этапе полученный сток RSV очищают с помощью ультрацентрифугирования.

Затем первичные иммунные клетки крови человека выделяют с помощью центрифугирования в градиенте плотности. На заключительном этапе выделенные иммунные клетки стимулируют вирусом. В конечном итоге клеточный иммунный ответ на инфекцию RSV можно оценить с помощью ELISA, QPCR или проточной цитометрии.

Данный метод является ценным дополнением к изучению инфекций, вызываемых респираторно-синцитиальным вирусом. RSV обладает высокой адаптивностью к человеку. Следовательно, для изучения воспалительных путей, участвующих в патогенезе вируса, важно использовать иммунные клетки человека.

Хотя в данном видео используется RSV, этот метод также можно легко адаптировать для изучения других вирусов, таких как вирус гриппа или риновирус. Начните с размораживания флакона с исходным стоком человеческого RSV на водяной бане при 37 °C. После размораживания вируса разведите сток в аликвотах инфекционной среды по 4 mL на одну колбу.

Поддерживая MOI на уровне 0,1 или ниже, добавьте вирус к клеткам heli, используя минимально возможный общий объем, чтобы предотвратить высыхание клеток. Затем инкубируйте культуры от двух до четырех часов при 37 °C и 5%CO2, перемешивая колбу каждые 15 минут для перераспределения среды. После этого удалите инокулят и один раз промойте клетки с помощью PBS.

Затем добавьте в флаконы по 15 миллилитров культуральной среды и инкубируйте их от трех до пяти дней при тех же условиях культивирования. Ежедневно один раз в день наблюдайте за клетками с помощью обычной микроскопии в светлом поле на предмет появления цитопатологических изменений, вызванных вирусом. При обнаружении таких изменений снимите клетки путем скребка для сбора RSV, затем соберите суспензию в стерильную пробирку объемом 50 миллилитров, подвергните клетки вортексированию и центрифугируйте в течение 10 минут при 1800 Gs и комнатной температуре для осаждения клеточного дебриса.

RSV не осаждается при такой скорости, поэтому супернатант можно хранить при минус 80 °C в объеме одного миллилитра в качестве посевного стока. Аликоты для последующего использования всегда подвергают мгновенной заморозке RSV в жидком азоте, чтобы предотвратить потерю инфекционных вирусных частиц. Для очистки RSV начните с помещения стерильной центрифужной пробирки в каждый стакан ультрацентрифуги.

Затем добавьте по 5 мл свежеприготовленного стерилизованного фильтрованием раствора сахарозы на дно каждой пробирки. После этого очень медленно добавьте 30 мл раствора RSV поверх раствора сахарозы, стараясь не перемешать слои и сохранить их четкое разделение. Затем, работая в ламинарном шкафу для поддержания стерильности, аккуратно сбалансируйте шесть стаканов для ультрацентрифугирования с помощью стерильного PBS с точностью до 0,1 г, учитывая вес крышек. Центрифугируйте вирус в течение 1,5 часов при 20 000 RCF и температуре 4 °C.

После завершения центрифугирования с помощью стерильного пинцета осторожно извлеките центрифужные пробирки из стаканов. Вирусные частицы пройдут через слой сахарозы и образуют осадок. Переверните центрифужные пробирки над колбой для вирусных отходов и дайте им полностью стечь на стерильной поверхности.

Не допускайте полного высыхания осадка. Затем осторожно пропустите 1 мл HPSS через осадок и снова наклоните центрифужную пробирку, чтобы слить HPSS. После этого снова переверните пробирку, стараясь не допустить высыхания осадка.

Теперь трижды ресуспендируйте осадок 40 раз в другом миллилитре HBSS, стараясь избегать образования пузырьков, так как это может разрушить вирус. Затем подвергните аликвоты вируса мгновенной заморозке в жидком азоте. Храните вирус при температуре -80 °C до количественного определения и дальнейшего использования. После получения крови в пробирках с 10 мл ЭДТА от здоровых добровольцев разведите кровь фосфатно-солевым буфером (PBS) комнатной температуры до двух раз, чтобы получить максимум 35 мл разведенной крови в пробирке объемом 50 мл.

Затем прикрепите стерильную иглу с замком Luer-lock к стерильному шприцу объемом 50 мл и наберите в шприц среду для центрифугирования в градиенте плотности. Поместите иглу на дно пробирки с разбавленной кровью и осторожно внесите 15 мл среды для центрифугирования под кровь, сохраняя четкую границу раздела между средой и кровью. Теперь центрифугируйте клетки в течение 20 минут при 800 ×g при комнатной температуре с максимальным ускорением и резкой остановкой. После центрифугирования эритроциты окажутся в осадке на дне пробирки, а над ними будет находиться серебристый слой нейтрофилов.

Прозрачный слой над осадком содержит среду градиента плотности, а тонкий слой между средой градиента плотности и верхним слоем плазмы крови содержит PBMC. С помощью пастеризованной пипетки осторожно соберите PBMC, затем перенесите клетки в новую пробирку объемом 50 мл на льду. Добавьте ледяной PBS до объема 50 мл и осадите клетки после завершения центрифугирования.

Отоصبите супернатант и дважды промойте осадок 50 миллилитрами ледяного PBS. После второго промывания добавьте к осадку один миллилитр ледяной среды, подсчитайте количество клеток и доведите концентрацию клеток до 5 × 10⁶ PBMC на миллилитр. Для стимуляции PBMC живым RSV сначала внесите по 100 микролитров PBMC в каждую лунку 96-луночного планшета с круглым дном. Затем добавьте в каждую лунку по 50 микролитров двух свежеразведенных стимулов.

Инкубируйте планшет в течение 24 часов при 37 °C и 5% CO2, затем центрифугируйте планшет и соберите супернатант для последующего анализа методом ELISA. Стимулированные PBMC в осадке можно проанализировать с помощью qPCR или окрасить для проточной цитометрии. При проведении эксперимента по стимуляции PBMC рекомендуется использовать метод фракционирования стимулов.

Условия разделены на стандартные стимулирующие условия, такие как RPMI или человеческий RSV, и условия с тестовыми фракциями, такими как mial, дипептид или LPS. Важно отметить, что в каждый эксперимент всегда включаются отрицательный контроль (только RPMI) и положительный контроль (LPS). После 24 часов стимуляции RSV различные популяции PBMC демонстрируют дозозависимую скорость инфицирования и различие в эффективности инфицирования RSV. После 24 часов стимуляции вирусом анализ qPCR PBMC на экспрессию TNF alpha или интерферона gamma показывает, что RSV вызывает выраженную активацию транскрипции этих двух воспалительных цитокинов. Напротив, стимуляция с помощью miam, дипептида или LPS приводит лишь к слабой экспрессии мРНК.

При одновременной стимуляции P BMCs как RSV, так и дипептидом MIAL наблюдается выраженное синергическое повышение экспрессии. Также был проведен анализ продукции TNF Alpha или интерферона гамма стимулированными pbmc с помощью метода ELISA. В отличие от результатов на уровне транскрипции, RSV является слабым индуктором секреции белков TNF alpha и интерферона гамма; стимуляция p BMCs дипептидом miam приводит к продукции низких количеств TNF alpha и отсутствию интерферона гамма.

Аналогично результатам транскрипционного анализа, уровни как TNF alpha, так и интерферона gamma демонстрируют синергетическое повышение при одновременной стимуляции RSV и дипептидом MIAM; данный контроль используется для определения того, зависит ли индукция цитокинов от репликации RSV. Клетки костного мозга (BMCs) человека стимулировали живым или инактивированным бета-пропиолактоном RSV; как показано на графиках, и живой, и инактивированный RSV индуцировали продукцию провоспалительных цитокинов. Не забывайте, что эксперименты с RSV должны проводиться в шкафу биологической безопасности в лаборатории с уровнем биобезопасности BSL-2.

Кроме того, при использовании данного метода крайне важно помнить о необходимости применения реагентов и материалов, не содержащих эндотоксинов, на протяжении всей процедуры. После просмотра этого видео у вас должно сложиться четкое представление о том, как стимулировать PBMC человека с помощью RSV, а также о нескольких анализах, которые могут быть использованы для изучения иммунного ответа.