Противоопухолевые комплексы металлов: синтез и цитотоксичности оценка по методу МТТ-анализ

Общая цель этой процедуры заключается в приготовлении противораковых металлопрепаратов и оценке их цитотоксичности с помощью анализа МТТ. Это достигается путем синтеза противораковых соединений на основе металлов. Вторым этапом является подготовка 96 лунок из раковых клеток.

Затем противораковые соединения на основе металлов вставляются в раковые клетки. Последним шагом является измерение жизнеспособности клеток с помощью анализа МТТ, где измеряется снижение МТТ митохондриальными и цитозольными ферментами до образования дзен, в конечном итоге противораковая активность и половина максимальной ингибирующей концентрации. Или я вижу, что определяется 50 значений соединений.

Как правило, люди, плохо знакомые с этим методом, могут испытывать трудности, потому что это многоступенчатая процедура, которая требует полного внимания лабораторного работника и имеет строгие временные рамки. Визуальная демонстрация этого метода имеет решающее значение, так как подготовка клеточной пластины не является простой задачей, поскольку работа с жизнеспособными клетками требует следования определенным рекомендациям. Работая в бардачке, приготовьте комплекс ванадия пять, растворив 0,42 ммиланола предшественника лиганда в сухом ТГФ.

Затем добавьте его в раствор для перемешивания эквивалентных количеств ванадия или трис изоп оксида в ТГФ. Перемешивайте реакционную смесь при комнатной температуре в течение 15 минут, прежде чем удалить летучие вещества под вакуумом. Далее добавляем холодный гексан и убираем его под вакуум.

Темно-фиолетовый порошок должен быть получен с количественным выходом. Взвесьте восемь миллиграмм полученного соединения во флаконе epi orph. Для приготовления комплекса титана четыре растворить 0,35 ммиланоля предшественника лиганда в сухом ТГФ и добавить его в раствор для перемешивания, эквивалентный количествам тетраизопса оксида титана в ТГФ.

Перемешайте реакционную смесь при комнатной температуре в течение двух часов. Затем удалите летучие вещества под вакуумом, чтобы получить желтый продукт с количественным выходом. Взвесьте восемь миллиграммов полученного соединения в флаконе с эф для получения клеток HT 29 в 96 лунках планшета первой культуры.

Элементы в колбе площадью 75 квадратных сантиметров, как описано в текстовом протоколе, удаляют среду, когда элементы HT 29 достигают максимальной беглости. Промыв клетки в одном миллилитре раствора трипсина ЭДТА, добавьте один миллилитр того же раствора и выдержите в течение пяти минут. Отсоедините клетки HT 29 от колбы и добавьте 10 миллилитров среды, чтобы отключить активность трипсина.

Переложите пять миллилитров клеточной смеси в пробирку. С помощью пипетки перенесите несколько капель клеточной смеси в контркамеру. Контркамера включает в себя две части квадратов пять на пять.

Подсчитайте клетки в пяти репрезентативных квадратах каждой части с помощью микроскопа. Четыре квадрата по углам и один квадрат посередине. Рассчитайте предполагаемое количество присутствующих клеток.

Просуммируйте ячейки в пяти репрезентативных квадратах каждой части. Рассчитайте среднюю сумму двух частей и разделите на 20. Далее разделите 0,6 на частное.

Полученное число – это количество клеточной смеси, необходимое на одну пластину. Этот расчет относится к пластине, содержащей 9 000 ячеек на лунку. С помощью пипетки соедините необходимое количество клеточной смеси на одну пластину с 13,2 миллилитрами среды.

Добавьте смесь в тарелку на 96 лунок. Использование 11-канальной пипетки по 200 микролитров на лунку в шести линиях, содержащих в общей сложности 66 лунок. Одна лунка каждой строки должна оставаться пустой для контроля заготовки.

Инкубируйте планшет при температуре 37 градусов Цельсия с 5% углекислым газом в течение 24 часов, чтобы позволить клеткам прикрепиться к пластине, чтобы сначала ввести соединения, добавьте 200 микролитров сухого ТГФ к восьми миллиграммам весового состава. Разбавьте раствор соединения, добавив сначала 60 микролитров ТГФ в девять различных файлов эйнора. Для каждого раствора с помощью пипетки переведите 60 микролитров из раствора соединения в первый файл эйнора.

Затем ресусцируют и переливают 60 микролитров в следующий флакон и так до тех пор, пока не будет получено 10 различных концентраций. Приступайте к разведению 20 микролитров каждой концентрации в ТГФ со 180 микролитрами среды. Кроме того, приготовьте раствор для контроля только растворителем, добавив 20 микролитров ТГФ на 180 микролитров среды.

Далее в каждую лунку добавляем по 10 микролитров из каждого полученного раствора. Что уже содержит 200 микролитров вышеупомянутого раствора клеток в среде, чтобы дать конечные концентрации соединения до 200 миллиграммов на литр. Каждая линия содержит клетки, обработанные соединением в 10 различных концентрациях.

Одна контрольная лунка, содержащая клетки, обработанные только растворителем, и одна лунка без ячеек Для контроля заготовки настройте линии, чтобы повторять каждое измерение соединения три раза. Инкубируйте загруженную пластину в течение трех дней при температуре 37 градусов Цельсия в атмосфере с содержанием углекислого газа 5%. Приготовьте решение МТТ, как описано в текстовом протоколе, с помощью 11-канальной пипетки.

Добавьте по 20 микролитров раствора МТТ в каждую лунку, кроме глухих контрольных лунок. Инкубируйте тарелку еще три часа после инкубации. Удалите раствор среды из каждой лунки и добавьте в каждую лунку по 200 микролитров изопропанола.

Чтобы формин растворился, перемешайте пластину в течение 30 минут до однородности. Измерьте поглощение на 550 нанометрах для 200 микролитров однородного раствора с помощью считывателя микропланшетов, спектрофотометра повторяя каждое измерение в три разных дня. Затем рассчитайте процент жизнеспособности клетки, вычитая значение поглощения контроля холостого элемента из измеренного значения, деля результат на поглощение контрольного значения растворителя THF и умножая на 100%Рассчитайте половину максимальных значений ингибирующей концентрации с помощью графического программного обеспечения.

Сообщаемый IC 50 представляет собой среднее арифметическое всех значений IC 50, собранных по крайней мере за три разных дня, а значение ошибки является стандартным отклонением. Данные, полученные в результате анализа МТТ, анализируются для оценки цитотоксичности соединения. Измерения должны быть выполнены в диапазоне концентраций, что позволит получить график, отображающий равномерное распределение точек, по крайней мере, трех точек на каждом плато и трех точек для определения склона.

Недостаточное количество измерений при высоких или низких концентрациях приведет к нарушению нелинейной регрессионной аппроксимации кривой, необходимой для определения значений IC 50, и, как следствие, к снижению их точности. Относительные значения IC 50, определенные с помощью нелинейной регрессионной аппроксимации, соответствуют концентрациям, приводящим к 50% возможного ингибирования роста клеток тестируемым соединением. Она рассчитывается как золотая середина между измеряемой максимальной и минимальной жизнеспособностью клеток, которые не обязательно равны 100% и 0% соответственно.

При осмотре результаты экспериментов описаны в протоколе. Понятно, что цисплатин, а также комплексы титана и ванадия обладают высокой активностью. Также заметно, что чем ближе максимальное значение ингибирования данного соединения к 100%, тем ближе относительное значение IC 50 к абсолютному при сравнении значений IC 50 среди различных соединений.

Комплекс титановых четырех обладает самой высокой цитотоксичностью, а его значения IC 50 ниже, чем у цисплатина и комплекса ванадия пять. Тем не менее, свободный лиганд проявляет заметно сниженную активность после последующего добавления лиганда в различных концентрациях. Жизнеспособность клеток падает не так существенно, как у ее комплексов.

Это гарантирует, что высокая противораковая активность комплексов опирается на металлические центры при попытке проведения данной процедуры. Важно всегда поддерживать стерильные условия. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как оценивать цитотоксичность ваших противораковых соединений с помощью M-T-T-S-A.