Введение в Saccharomyces cerevisiae

Saccharomyces cerevisiae, также известная как пекарские дрожжи, является одним из многих модельных организмов, изучаемых в лабораториях по всему миру. Благодаря тому, что ее геном секвенирован, ее генетика легко поддается манипуляциям, а сам вид неприхотлив в лабораторном содержании, эти дрожжи стали неоценимым ресурсом для понимания фундаментальных клеточных процессов, таких как деление и гибель клеток. В данном видео представлен обзор этого модельного организма и широкий спектр областей его применения в биологических и биомедицинских исследованиях.

Дрожжи относятся к домену Eukaryota, который состоит из организмов с ограниченным мембраной ядром, называемых эукариотами. Вместе с грибами и плесенью S. cerevisiae относится к царству Fungi из-за наличия клеточной стенки из хитина — полисахаридного полимера, который встречается не только у грибов, но и в экзоскелетах насекомых и ракообразных.

Примечательно, что многие белки, обнаруженные у дрожжей, имеют схожие последовательности с белками других эукариот. Эти белки часто являются гомологичными, и сходство их последовательностей указывает на то, что данные организмы имеют общего предка. Исследуя функцию конкретного белка у дрожжей, исследователи получают представление о функции этого белка у высших эукариот, таких как люди.

В природе S. cerevisiae встречается в теплых, влажных средах, где имеется доступ к источнику сахара. Одно из излюбленных мест их обитания — виноградники, где они живут на кожице винограда.

S. cerevisiae имеет округлую или эллипсовидную яйцевидную форму; при визуализации с помощью микроскопа в светлом поле их диаметр обычно составляет 5-10 мкм.

Когда большинство эукариотических клеток делятся путем митоза и цитокинеза, происходит равное распределение генетического материала и цитоплазмы между дочерними клетками. С другой стороны, S. cerevisiae подвергается делению клеток посредством процесса, называемого почкованием.

Эта форма бесполого размножения включает формирование синтезируемой заново почки из материнской клетки, которая растет в размере на протяжении всего клеточного цикла до момента цитокинеза. В отличие от типичного деления эукариотических клеток, после митоза две клетки оказываются неодинаковыми по размеру.

Теперь, когда мы немного познакомились с S. cerevisiae как с организмом, давайте обсудим, что делает его отличной модельной системой для исследований.

Во-первых, клетки дрожжей быстро растут и делятся примерно каждые 90 минут. Во-вторых, их легко культивировать; для размножения требуются лишь простые методы и оборудование. В-третьих, поскольку S. cerevisiae стал первым эукариотическим организмом, чей геном был полностью секвенирован, все его последовательности генов общедоступны через базу данных генома дрожжей.

Генетические манипуляции с дрожжами также крайне практичны. Большинство векторов S. cerevisiae, которые являются носителями интересующей последовательности ДНК, представляют собой челночные векторы. Челночные векторы — это обычно плазмиды, способные реплицироваться в двух разных видах, например, как в E. coli, так и в S. cerevisiae. Это позволяет проводить молекулярное клонирование в E. coli — например, чтобы включить ген зеленого флуоресцентного белка медузы в челночный вектор, который затем может быть введен в дрожжи, чтобы заставить их светиться.

Интегративная плазмида дрожжей — это тип челночного вектора, который позволяет встраивать чужеродную ДНК в геном дрожжей посредством процесса, называемого гомологичной рекомбинацией. Гомологичная рекомбинация представляет собой обмен фрагментами ДНК между идентичными или схожими последовательностями, что приводит к генетическому кроссинговеру между вектором и геномной ДНК хозяина. Это может привести к нокауту гена или замене одного гена другим. Кроме того, поскольку гомологичная рекомбинация приводит к интеграции в геном хозяина, генетическое изменение сохраняется после деления дрожжевой клетки.

Теперь, когда вы знаете, что делает дрожжи столь удобными для изучения, давайте разберем, почему эти маленькие организмы имели такое большое научное значение. Давно, еще в начале VI тысячелетия до н. э., дрожжи использовались для ферментации винограда при производстве вина. Позже дрожжи сыграли важную роль в выпечке хлеба в Древнем Египте.

Лишь в 1856 году Луи Пастер идентифицировал S. cerevisiae как ключевой микроорганизм в виноделии и хлебопечении. Он классифицировал дрожжи как факультативных анаэробов, которые при отсутствии кислорода переключаются на ферментацию — процесс, позволяющий дрожжам метаболизировать сахара с образованием спирта в качестве побочного продукта. В ходе этого процесса пируват, образующийся при гликолизе, восстанавливается до ацетальдегида, который затем, благодаря преобразованию NADH в NAD+, восстанавливается до этанола — основного компонента вина.

Перенесемся в XX век: Хартвелл и Нерс обнаружили в дрожжах белки, регулирующие клеточный цикл.

Клеточный цикл представляет собой серию клеточных событий, которая включает правильную репликацию и сегрегацию ядерной DNA перед делением клетки. Идентификация белка циклина и циклин-зависимой киназы, а также изменение их относительного содержания в течение интерфазы и митоза, позволили предположить, что эти белки являются ключевыми регуляторами деления клеток. Высокая консервативность этих белков делает их изучение на дрожжах ценным для понимания роли циклин-зависимых киназ в многоклеточных организмах, например, при нарушении регуляции клеточного цикла, что может привести к неконтролируемому делению клеток или раку.

Спустя 15 лет Блэкберн, Грайдер и Шостак провели прорывные исследования по изучению теломер, а также открыли теломеразы. Теломеры — это повторяющиеся последовательности DNA на концах хромосом, которые предотвращают деградацию геномной DNA. Добавление этих повторяющихся последовательностей осуществляется теломеразами на 3’-флангирующем конце хромосомы, после чего DNA-полимераза дополняет нуклеотиды в отстающей цепи. Теломеры имеют значение для процесса старения, так как эти сегменты DNA укорачиваются на протяжении жизни организма.

Еще позже, в 1992 году, Осуми и его коллеги обнаружили гены, регулирующие аутофагию — своего рода клеточную переработку. При дефиците питательных веществ ненужные органеллы поглощаются аутофагосомой. Затем аутофагосома сливается с лизосомой для дальнейшего расщепления белков органелл до аминокислот, необходимых для синтеза новых белков. Аутофагия участвует в важных клеточных механизмах защиты от вторгающихся патогенов и роста опухолей.

Существует широкий спектр областей применения дрожжей в исследованиях. Например, дрожжи могут использоваться для изучения митофагии — процесса удаления поврежденных митохондрий автофагосомами. Этот процесс имеет значение при таких заболеваниях, как болезни Альцгеймера и Паркинсона. В данном видео в клетках дрожжей индуцируют автофагию путем добавления среды с азотным голоданием. Затем клетки подготавливают к флуоресцентной микроскопии, чтобы пронаблюдать митофагию в клетках, находящихся в условиях азотного голодания.

S. cerevisiae используют для экспрессии и очистки больших количеств белков, например, регуляторного белка трансмембранной проводимости муковисцидоза (CFTR). В этом видео выращивают большие культуры дрожжевых клеток, несущих плазмиду CFTR. Затем проводят центрифугирование клеток для выделения микросом. Микросомы представляют собой артефактные везикулы, образующиеся из эндоплазматического ретикулума при разрушении клеток. Выделение и очистка CFTR из микросом позволят ученым изучить структуру белка с помощью таких методов, как рентгеновская кристаллография.

Дрожжи также могут служить модельной системой для генетических исследований белков репарации ДНК человека. Эти белки обнаруживают и исправляют поврежденную ДНК, чтобы предотвратить пролиферацию клеток с дефектным геномом, например, раковых клеток. Здесь вы видите, как авторы высевают дрожжевые клетки с трансформированным белком репарации ДНК WRN на чашки с селективными средами. Морфологию клеток мутантов по WRN можно визуализировать с помощью флуоресцентной микроскопии, а обнаружение этого белка в клеточном лизате проводят путем электрофореза белков в геле с последующим вестерн-блоттингом.

Вы только что посмотрели вводное видео JoVE о S. cerevisiae. В этом ролике мы рассмотрели историю, клеточную и молекулярную биологию, а также биомедицинское применение S. cerevisiae. Надеемся, вам понравилось наше видео, и предлагаем поделиться им с коллегами.