Стресс-индуцированной антибиотиков Восприимчивость Тестирование на чип

Общая цель данного эксперимента заключается в быстром определении чувствительности бактерий к интересующим антибиотикам. Это достигается путем первичной иммобилизации бактерий логарифмической фазы на дно микрофлюидного канала. На втором этапе среда, содержащая антибиотик и живой мертвый флуоресцентный краситель, проталкивается через канал с высокой скоростью потока, подвергая бактерии стрессу и активируя их биохимические пути, нацеленные на антибиотики.

Контрастные и флуоресцентные изображения следующей фазы автоматически собираются каждые две минуты в течение одного часа для мониторинга жизнеспособности бактерий, нормализованный процент гибели бактерий рассчитывается на основе полученных изображений в каждой временной точке эксперимента. В конечном счете, фенотип чувствительности бактерий к антибиотикам определяется по увеличению процента нормализации гибели клеток с течением времени. Основное преимущество этой методики перед существующими фенотипическими методами тестирования чувствительности, такими как бульон, разведение или микрокультура, заключается в том, что наш метод не требует мониторинга деления бактерий.

Скорее, мы можем получить доступ к их профилю восприимчивости непосредственно из существующей небольшой популяции. Последствия этого метода распространяются на диагностику устойчивых бактериальных инфекций, поскольку метод быстрый, может быть легко мультиплексирован и автоматизирован Чтобы создать слой PDMS, начните с дегазации свежеприготовленной вязкой смеси PDMS в вакуумной камере при комнатной температуре через час, используйте весы для заполнения алюминиевой формы заранее определенной массой смеси DGA PDMS. Медленно вылейте PDMS по центру формы, следя за тем, чтобы форма была ровной, а штифты не закрывались.

Высушите PDMS в течение ночи в духовке при температуре 37 градусов Цельсия. На следующее утро отпустите верхнюю пластину формы и осторожно извлеките отвержденный PDMS из формы, чтобы собрать проточную ячейку. Сначала поместите стеклянное окошко в карман проточной ячейки.

Затем наложите предметное стекло с покрытием на стеклянное окошко внутрь кармана проточной ячейки активной стороной вверх. Только что созданный слой PDMS с каналами вниз поверх него таким образом, чтобы входы каналов совпадали со сквозными отверстиями в металлической пластине. Аккуратно вытолкните воздух между слоями, а затем переверните стеклянную застежку PDMS так, чтобы PDMS была обращена к стеклянному окну.

Перекрыть входы канала PDMS со сквозными отверстиями в металлической пластине, а затем поместите прижимную пластину сверху и затяните винты. Теперь поместите собранную проточную ячейку под микроскоп, установите увеличение микроскопа на 60 раз и предварительно выровняйте положения каналов, чтобы подготовить логарифмическую фазу бактерий для загрузки в проточную ячейку, смешайте 50 микролитров интересующей за ночь культивируемой бактериальной колонии с 50 миллилитрами свежего бульона MH два. Выдерживать в течение трех часов с встряхиванием при 250 об/мин и 37 ° Цельсия после центрифугирования субкультуры 10 миллилитров культуры в течение двух минут при 1,650 G и комнатной температуре.

Затем достаньте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте гранулу в одном миллилитре свежей МН двух сред. Затем прикрепите короткую длину трубки к одномиллилилитровому шприцу и промойте трубку одним миллилитром среды, оставив небольшое количество среды в трубке, чтобы избежать образования пузырьков воздуха при втягивании бактериальной суспензии. Затем загрузите 0,7 миллилитра бактерий в шприц и заполните два канала проточной ячейки культурой бактериальных клеток.

Прозрачность канала меняется по мере его заполнения бактериями. Затем инкубируйте проточную ячейку в течение 45 минут при температуре 37 градусов Цельсия, чтобы бактерии могли прикрепиться к поверхности предметного стекла. Подготовить растворы для проведения эксперимента.

Сначала наполните два 60 миллилитровых шприца свежеприготовленным контрольным раствором и два 60 миллилитровых шприца свежеприготовленным раствором антибиотика. Взбейте шприцы, чтобы удалить пузырьки воздуха, а затем прикрепите входную трубку, проталкивая соответствующие растворы через конец трубки. Храните растворы завернутыми в алюминиевую фольгу, чтобы избежать деградации реагентов, вызванной светом.

Теперь установите шприцы с экспериментальным раствором на насос по одному. При необходимости сожмите их поршни, чтобы установить их на насос. Зафиксируйте шприцы на месте с помощью перекладины, удерживающей шприц.

Установите скорость насоса на один миллилитр в минуту, а объем насоса на 60 миллилитров и промойте насос до тех пор, пока из всех шприцев не будет виден равномерный поток жидкости. Теперь начните эксперимент, извлеките проточную ячейку из инкубатора и установите ее на предметный столик микроскопа. Затем подсоедините одну входную трубку, идущую от шприца, и одну выходную трубку, идущую к бутылке для отходов, к каждому из каналов проточной ячейки.

На этом этапе эксперимент полностью настроен и готов к началу. Установите время регистрации фазового контраста равным 10 миллисекундам и время регистрации флуоресценции равным 1600 миллисекундам, а затем получите фазово-контрастные и флуоресцентные изображения для каждой позиции перед началом потока. Обратите внимание, что до начала съемки потока фокусировка на дне канала может быть недостижима из-за высокой плотности бактерий внутри канала.

Теперь запустите поток жидкости. Сразу же проверьте, что микроскоп сфокусирован на дне каналов. Затем сделайте фазово-контрастные и флуоресцентные изображения целевых областей в течение первой минуты потока.

Получайте изображения каждые две минуты после первого набора изображений до тех пор, пока не пройдет 60 минут потока. При необходимости перефокусировавшись, чтобы убедиться в правильности проведения эксперимента, можно изучить полученные данные фазового контраста и флуоресценции. В этой выборке данных восприимчивый штамм был загружен в первый и второй каналы, в то время как резистентный штамм был загружен в третий и четвертый каналы.

В конце эксперимента запустите цикл очистки с последовательным нанесением отбеливателя и воды. Наполните четыре шприца по 20 миллилитров 10 миллилитров 10%-ным раствором отбеливателя и четыре шприца по 60 миллилитров водой. После удаления пузырьков присоедините шприцы, наполненные отбеливателем, к проточной ячейке и установите скорость насоса на один миллилитр в минуту и объем насоса на три миллилитра.

Запустите насос на три минуты, следите за очисткой канала на экране. Через три минуты замените шприцы с отбеливателем на водяные и работайте в течение 30 минут по одному миллилитру в минуту. Наконец, подсчитайте количество бактерий на каждом изображении с помощью программного обеспечения для обработки изображений.

Рассчитайте нормализованный процент гибели бактериальных клеток в зависимости от времени по следующей формуле, где NF равен количеству мертвых бактерий, подсчитанному при подсчете флуоресцентного изображения. А NP равно общему количеству бактерий, определенному по фазово-контрастному изображению. Показанные здесь изображения иллюстрируют зависящую от времени реакцию восприимчивого штамма стафилококка aria на оксациллин внутри микрофлюидной проточной ячейки.

Эти квадранты показывают фазово-контрастные изображения, полученные через одну минуту после начала эксперимента и через час с соответствующими флуоресцентными изображениями, показанными здесь. К концу эксперимента наблюдается значительное увеличение количества флуоресцентных бактерий, что указывает на гибель клеток внутри канала и восприимчивость штамма к антибиотику из-за стохастической неоднородности отдельных предметных стекол, покрытых эпоксидной смолой. На протяжении всего эксперимента может наблюдаться потеря бактериальных клеток при длительном чистом стрессе, чтобы объяснить эту вариацию, каждое флуоресцентное изображение популяции мертвых клеток нормализуется с помощью полученного со-фазового контрастного изображения, дающего общую популяцию клеток с точностью до одной секунды до того же момента времени.

Эти увеличения демонстрируют, что алгоритм подсчета более успешен в точном подсчете отдельных бактерий на флуоресцентных изображениях, чем на плотно заселенных фазово-контрастных изображениях. Окрашивание мертвых клеток дает высокий контраст флуоресценции для отдельных мертвых бактерий. Поскольку количество флуоресцентных бактерий редко превышает 5% от общего числа, каждая бактерия очень яркая по сравнению с фоном.

Таким образом, флуоресцентные бактерии могут быть легко подсчитаны с высокой степенью точности. Например, в этом эксперименте из 5 828 обнаруженных бактерий, выделенных красным цветом, 174 были определены как мертвые. Нормализованные данные MSSA и Mr.RSA для трех различных экспериментов проиллюстрированы так, как и ожидалось: для устойчивых штаммов нормализованная гибель клеток имеет низкую магнитуду менее 0,5% и не изменяется в течение эксперимента.

Восприимчивые штаммы, однако, демонстрируют устойчивое увеличение гибели клеток и более высокое значение, превышающее 1% к концу эксперимента. Начало клеточной гибели восприимчивых штаммов незначительно варьируется от эксперимента к эксперименту, но обычно происходит от 10 до 30 минут. Не забывайте, что работа с устойчивыми к антибиотикам патогенами может быть чрезвычайно опасной, и при выполнении этой процедуры всегда следует соблюдать меры предосторожности, такие как септическая техника.

Этот метод проложит путь для исследователей к изучению того, как бактерии реагируют на стресс, и повлияет на разработку новых методов быстрой диагностики и открытие новых лекарств.