Трансформация и клонирование дрожжей
Дрожжи или Saccharomyces cerevisiae представляют собой широко распространенный простой эукариотический модельный организм, используемый в исследованиях в области генетики и клеточной биологии, который позволяет получить представление о клеточных процессах человека. В данном видео рассматривается трансформация — поглощение чужеродной ДНК клеткой дрожжей. Будут представлены плазмиды дрожжей, способы подготовки дрожжевых клеток к трансформации, пошаговая процедура трансформации, а также некоторые области применения этого фундаментального метода.
Прежде чем перейти к трансформации дрожжей, давайте обсудим тип ДНК, используемый при трансформации: плазмиду. Плазмида представляет собой небольшую кольцевую двухцепочечную ДНК, способную к суперспирализации, что позволяет ей легко проходить через поры клеточной мембраны.
Плазмиды содержат полилинкер или MCS (multiple cloning site), в котором рестрикционные эндонуклеазы, также известные как "рестриктазы", могут расщеплять ДНК. Фрагменты ДНК, представляющие интерес и разрезанные теми же ферментами, затем могут быть лигированы в MCS. Плазмиды также содержат точку начала репликации или ORI, которая служит сигналом для клетки о том, где должна начаться репликация. Кроме того, плазмиды имеют селективный маркер, который позволяет клеткам дрожжей, содержащим плазмиду, расти в определенных условиях окружающей среды. Дрожжи, которые не смогли успешно включить плазмиду, не выживут в средах, содержащих селективный маркер. Селективные маркеры могут кодировать гены лекарственной устойчивости или гены ферментов, позволяющих штамму дрожжей синтезировать аминокислоты, которые они иначе не способны производить.
Шаттл-векторы — это плазмиды, которые могут реплицироваться в нескольких видах хозяев. Например, плазмида из E. Coli может расти в дрожжах. Плазмиды дрожжей могут быть неинтегрирующими или интегрирующими; это означает, что плазмида либо объединяется с геномной ДНК, либо остается независимой.
Существует пять основных типов плазмид или векторов, используемых у дрожжей. Два наиболее часто используемых при трансформации дрожжей — это эписомальные плазмиды дрожжей (YEp) и центромерные плазмиды дрожжей (YCp). Оба этих типа векторов содержат последовательность автономной репликации или ARS. ARS содержит точку начала репликации и обеспечивает экстрахромосомную репликацию в дрожжах.
Для трансформации дрожжей можно использовать несколько различных процедур, включая метод сферопластов, электропорацию и трансформацию с использованием ацетата лития. В данном видео мы сосредоточимся на процедуре с применением ацетата лития.
При этом методе трансформации положительно заряженные катионы лития нейтрализуют заряды на клеточной мембране и плазмидной ДНК. Одноцепочечная ДНК, добавляемая в трансформирующую смесь, связывается с клеточной стенкой дрожжей, в результате чего плазмидная ДНК остается доступной для поглощения дрожжевыми клетками. Воздействие резкого повышения температуры, или тепловой шок, создает разницу давлений между внутренней и внешней средами клетки, что приводит к образованию пор, через которые может пройти плазмидная ДНК. При понижении температуры клеточная стенка дрожжей восстанавливается, и процесс трансформации завершается.
Начнем с пошагового описания процедуры подготовки дрожжей к трансформации. Подготовка клеток дрожжей начинается с отбора колонии с агарной пластины и ее амплификации в среде из дрожжевого экстракта, пептона и декстрозы, сокращенно YPD, которая представляет собой полноценную среду для роста дрожжей.
После того как колония отобрана с пластины и помещена в среду YPD, культуру инкубируют в течение ночи при 30 °C с перемешиванием на шейкере или роллере, как показано здесь. Клетки дрожжей осаждают путем центрифугирования, после чего супернатант удаляют. Осажденные клетки ресуспендируют в необходимом буфере или стерильной воде. Эти подготовленные компетентные клетки дрожжей будут использованы в процедуре трансформации.
После подготовки клеток дрожжей можно приступать к трансформации, начав с приготовления трансформационной смеси.
Данная смесь реагентов должна включать: стерильную дистиллированную воду, 50% раствор полиэтиленгликоля (PEG), 1M литий-ацетат, раствор одноцепочечной ДНК в концентрации 10 mg/ml, плазмидную ДНК и компетентные клетки дрожжей. Точные пропорции каждого раствора следует рассчитать перед началом эксперимента, обратившись к стандартному протоколу трансформации дрожжей, принятому в вашей лаборатории.
Затем смесь инкубируют при 30 °C в течение 30 минут при встряхивании. Раствор следует перемешивать аккуратно, не используя вортекс, чтобы избежать разрушения клеток дрожжей.
Клетки подвергают тепловому шоку путем помещения в водяную баню при 42 °C на 15 минут с последующим охлаждением на льду в течение 2 минут. Затем клетки собирают с помощью центрифугирования.
Клетки ресуспендируют в дважды дистиллированной воде и высевают на агарные пластины для селекции нужных трансформантов. Пластины для трансформации инкубируют при 30 °C от двух до четырех дней до появления колоний.
До оптимизации процедура трансформации всегда должна включать пластины положительного и отрицательного контроля. Положительный контроль представляет собой суспензию клеток дрожжей с плазмидной ДНК на пластине YPD, не содержащей селективных маркеров; это подтверждает жизнеспособность клеток после процедуры трансформации. Отрицательный контроль представляет собой суспензию клеток дрожжей на соответствующей селективной пластине, например, содержащей антибиотики. На такой пластине не должно быть колоний, что свидетельствует об отсутствии контаминации.
Трансформация дрожжей имеет множество различных областей применения. Одним из таких применений является использование дрожжевой двухгибридной системы для идентификации белков, которые взаимодействуют с интересующим вас белком, или белком-приманкой. Когда плазмида из библиотеки потенциальных партнеров по связыванию, или белков-добычи, трансформируется и происходит взаимодействие, высвобождается транскрипционный фактор, который активирует репортерный ген, такой как Beta-galactosidase. Репортерный ген окрасит колонии, в которых произошло взаимодействие, в синий цвет на чашках, содержащих X-gal — субстрат для бета-галактозидазы.
С помощью метода сексуального циклирования в дрожжах можно создать множественные делеции. Гаплоидные клетки, содержащие репортер и делетированный локус, объединяются в одну клетку путем случайного распределения или мейотической рекомбинации. Для отбора дрожжей, в которых делеции были успешно инкорпорированы, используются селективные маркеры. В данном случае для отбора клеток, экспрессирующих GFP, применяется проточная цитометрия.
Дрожжи могут быть трансформированы белками с флуоресцентной меткой для изучения влияния мутаций на белок-белковые взаимодействия. В данной видеостатье использовалась флуоресцентная микроскопия для изучения влияния различных мутаций на белок-белковые взаимодействия, необходимые для эндоцитоза.
Вы только что посмотрели видео JoVE по трансформации дрожжей. Теперь вы должны понимать основные аспекты строения плазмиды, способы подготовки дрожжевых клеток к трансформации и порядок проведения самой процедуры трансформации. Как всегда, спасибо за просмотр!
S. cerevisiae представляют собой одноклеточные эукариоты, которые широко используются в качестве модельного организма в биологических исследованиях. В…
Дрожжи или Saccharomyces cerevisiae представляют собой широко распространенный простой эукариотический модельный организм, используемый в исследованиях в области генетики и клеточной биологии, который позволяет получить представление о клеточных процессах человека. В данном видео рассматривается трансформация — поглощение чужеродной ДНК клеткой дрожжей. Будут представлены плазмиды дрожжей, способы подготовки дрожжевых клеток к трансформации, пошаговая процедура трансформации, а также некоторые области применения этого фундаментального метода.
Прежде чем перейти к трансформации дрожжей, давайте обсудим тип ДНК, используемый при трансформации: плазмиду. Плазмида представляет собой небольшую кольцевую двухцепочечную ДНК, способную к суперспирализации, что позволяет ей легко проходить через поры клеточной мембраны.
Плазмиды содержат полилинкер или MCS (multiple cloning site), в котором рестрикционные эндонуклеазы, также известные как "рестриктазы", могут расщеплять ДНК. Фрагменты ДНК, представляющие интерес и разрезанные теми же ферментами, затем могут быть лигированы в MCS. Плазмиды также содержат точку начала репликации или ORI, которая служит сигналом для клетки о том, где должна начаться репликация. Кроме того, плазмиды имеют селективный маркер, который позволяет клеткам дрожжей, содержащим плазмиду, расти в определенных условиях окружающей среды. Дрожжи, которые не смогли успешно включить плазмиду, не выживут в средах, содержащих селективный маркер. Селективные маркеры могут кодировать гены лекарственной устойчивости или гены ферментов, позволяющих штамму дрожжей синтезировать аминокислоты, которые они иначе не способны производить.
Шаттл-векторы — это плазмиды, которые могут реплицироваться в нескольких видах хозяев. Например, плазмида из E. Coli может расти в дрожжах. Плазмиды дрожжей могут быть неинтегрирующими или интегрирующими; это означает, что плазмида либо объединяется с геномной ДНК, либо остается независимой.
Существует пять основных типов плазмид или векторов, используемых у дрожжей. Два наиболее часто используемых при трансформации дрожжей — это эписомальные плазмиды дрожжей (YEp) и центромерные плазмиды дрожжей (YCp). Оба этих типа векторов содержат последовательность автономной репликации или ARS. ARS содержит точку начала репликации и обеспечивает экстрахромосомную репликацию в дрожжах.
Для трансформации дрожжей можно использовать несколько различных процедур, включая метод сферопластов, электропорацию и трансформацию с использованием ацетата лития. В данном видео мы сосредоточимся на процедуре с применением ацетата лития.
При этом методе трансформации положительно заряженные катионы лития нейтрализуют заряды на клеточной мембране и плазмидной ДНК. Одноцепочечная ДНК, добавляемая в трансформирующую смесь, связывается с клеточной стенкой дрожжей, в результате чего плазмидная ДНК остается доступной для поглощения дрожжевыми клетками. Воздействие резкого повышения температуры, или тепловой шок, создает разницу давлений между внутренней и внешней средами клетки, что приводит к образованию пор, через которые может пройти плазмидная ДНК. При понижении температуры клеточная стенка дрожжей восстанавливается, и процесс трансформации завершается.
Начнем с пошагового описания процедуры подготовки дрожжей к трансформации. Подготовка клеток дрожжей начинается с отбора колонии с агарной пластины и ее амплификации в среде из дрожжевого экстракта, пептона и декстрозы, сокращенно YPD, которая представляет собой полноценную среду для роста дрожжей.
После того как колония отобрана с пластины и помещена в среду YPD, культуру инкубируют в течение ночи при 30 °C с перемешиванием на шейкере или роллере, как показано здесь. Клетки дрожжей осаждают путем центрифугирования, после чего супернатант удаляют. Осажденные клетки ресуспендируют в необходимом буфере или стерильной воде. Эти подготовленные компетентные клетки дрожжей будут использованы в процедуре трансформации.
После подготовки клеток дрожжей можно приступать к трансформации, начав с приготовления трансформационной смеси.
Данная смесь реагентов должна включать: стерильную дистиллированную воду, 50% раствор полиэтиленгликоля (PEG), 1M литий-ацетат, раствор одноцепочечной ДНК в концентрации 10 mg/ml, плазмидную ДНК и компетентные клетки дрожжей. Точные пропорции каждого раствора следует рассчитать перед началом эксперимента, обратившись к стандартному протоколу трансформации дрожжей, принятому в вашей лаборатории.
Затем смесь инкубируют при 30 °C в течение 30 минут при встряхивании. Раствор следует перемешивать аккуратно, не используя вортекс, чтобы избежать разрушения клеток дрожжей.
Клетки подвергают тепловому шоку путем помещения в водяную баню при 42 °C на 15 минут с последующим охлаждением на льду в течение 2 минут. Затем клетки собирают с помощью центрифугирования.
Клетки ресуспендируют в дважды дистиллированной воде и высевают на агарные пластины для селекции нужных трансформантов. Пластины для трансформации инкубируют при 30 °C от двух до четырех дней до появления колоний.
До оптимизации процедура трансформации всегда должна включать пластины положительного и отрицательного контроля. Положительный контроль представляет собой суспензию клеток дрожжей с плазмидной ДНК на пластине YPD, не содержащей селективных маркеров; это подтверждает жизнеспособность клеток после процедуры трансформации. Отрицательный контроль представляет собой суспензию клеток дрожжей на соответствующей селективной пластине, например, содержащей антибиотики. На такой пластине не должно быть колоний, что свидетельствует об отсутствии контаминации.
Трансформация дрожжей имеет множество различных областей применения. Одним из таких применений является использование дрожжевой двухгибридной системы для идентификации белков, которые взаимодействуют с интересующим вас белком, или белком-приманкой. Когда плазмида из библиотеки потенциальных партнеров по связыванию, или белков-добычи, трансформируется и происходит взаимодействие, высвобождается транскрипционный фактор, который активирует репортерный ген, такой как Beta-galactosidase. Репортерный ген окрасит колонии, в которых произошло взаимодействие, в синий цвет на чашках, содержащих X-gal — субстрат для бета-галактозидазы.
С помощью метода сексуального циклирования в дрожжах можно создать множественные делеции. Гаплоидные клетки, содержащие репортер и делетированный локус, объединяются в одну клетку путем случайного распределения или мейотической рекомбинации. Для отбора дрожжей, в которых делеции были успешно инкорпорированы, используются селективные маркеры. В данном случае для отбора клеток, экспрессирующих GFP, применяется проточная цитометрия.
Дрожжи могут быть трансформированы белками с флуоресцентной меткой для изучения влияния мутаций на белок-белковые взаимодействия. В данной видеостатье использовалась флуоресцентная микроскопия для изучения влияния различных мутаций на белок-белковые взаимодействия, необходимые для эндоцитоза.
Вы только что посмотрели видео JoVE по трансформации дрожжей. Теперь вы должны понимать основные аспекты строения плазмиды, способы подготовки дрожжевых клеток к трансформации и порядок проведения самой процедуры трансформации. Как всегда, спасибо за просмотр!
Дрожжи или Saccharomyces cerevisiae представляют собой широко распространенный простой эукариотический модельный организм, используемый в исследованиях в области генетики и клеточной биологии, который позволяет получить представление о клеточных процессах человека. В данном видео рассматривается трансформация — поглощение чужеродной ДНК клеткой дрожжей. Будут представлены плазмиды дрожжей, способы подготовки дрожжевых клеток к трансформации, пошаговая процедура трансформации, а также некоторые области применения этого фундаментального метода.
Прежде чем перейти к трансформации дрожжей, давайте обсудим тип ДНК, используемый при трансформации: плазмиду. Плазмида представляет собой небольшую кольцевую двухцепочечную ДНК, способную к суперспирализации, что позволяет ей легко проходить через поры клеточной мембраны.
Плазмиды содержат полилинкер или MCS (multiple cloning site), в котором рестрикционные эндонуклеазы, также известные как "рестриктазы", могут расщеплять ДНК. Фрагменты ДНК, представляющие интерес и разрезанные теми же ферментами, затем могут быть лигированы в MCS. Плазмиды также содержат точку начала репликации или ORI, которая служит сигналом для клетки о том, где должна начаться репликация. Кроме того, плазмиды имеют селективный маркер, который позволяет клеткам дрожжей, содержащим плазмиду, расти в определенных условиях окружающей среды. Дрожжи, которые не смогли успешно включить плазмиду, не выживут в средах, содержащих селективный маркер. Селективные маркеры могут кодировать гены лекарственной устойчивости или гены ферментов, позволяющих штамму дрожжей синтезировать аминокислоты, которые они иначе не способны производить.
Шаттл-векторы — это плазмиды, которые могут реплицироваться в нескольких видах хозяев. Например, плазмида из E. Coli может расти в дрожжах. Плазмиды дрожжей могут быть неинтегрирующими или интегрирующими; это означает, что плазмида либо объединяется с геномной ДНК, либо остается независимой.
Существует пять основных типов плазмид или векторов, используемых у дрожжей. Два наиболее часто используемых при трансформации дрожжей — это эписомальные плазмиды дрожжей (YEp) и центромерные плазмиды дрожжей (YCp). Оба этих типа векторов содержат последовательность автономной репликации или ARS. ARS содержит точку начала репликации и обеспечивает экстрахромосомную репликацию в дрожжах.
Для трансформации дрожжей можно использовать несколько различных процедур, включая метод сферопластов, электропорацию и трансформацию с использованием ацетата лития. В данном видео мы сосредоточимся на процедуре с применением ацетата лития.
При этом методе трансформации положительно заряженные катионы лития нейтрализуют заряды на клеточной мембране и плазмидной ДНК. Одноцепочечная ДНК, добавляемая в трансформирующую смесь, связывается с клеточной стенкой дрожжей, в результате чего плазмидная ДНК остается доступной для поглощения дрожжевыми клетками. Воздействие резкого повышения температуры, или тепловой шок, создает разницу давлений между внутренней и внешней средами клетки, что приводит к образованию пор, через которые может пройти плазмидная ДНК. При понижении температуры клеточная стенка дрожжей восстанавливается, и процесс трансформации завершается.
Начнем с пошагового описания процедуры подготовки дрожжей к трансформации. Подготовка клеток дрожжей начинается с отбора колонии с агарной пластины и ее амплификации в среде из дрожжевого экстракта, пептона и декстрозы, сокращенно YPD, которая представляет собой полноценную среду для роста дрожжей.
После того как колония отобрана с пластины и помещена в среду YPD, культуру инкубируют в течение ночи при 30 °C с перемешиванием на шейкере или роллере, как показано здесь. Клетки дрожжей осаждают путем центрифугирования, после чего супернатант удаляют. Осажденные клетки ресуспендируют в необходимом буфере или стерильной воде. Эти подготовленные компетентные клетки дрожжей будут использованы в процедуре трансформации.
После подготовки клеток дрожжей можно приступать к трансформации, начав с приготовления трансформационной смеси.
Данная смесь реагентов должна включать: стерильную дистиллированную воду, 50% раствор полиэтиленгликоля (PEG), 1M литий-ацетат, раствор одноцепочечной ДНК в концентрации 10 mg/ml, плазмидную ДНК и компетентные клетки дрожжей. Точные пропорции каждого раствора следует рассчитать перед началом эксперимента, обратившись к стандартному протоколу трансформации дрожжей, принятому в вашей лаборатории.
Затем смесь инкубируют при 30 °C в течение 30 минут при встряхивании. Раствор следует перемешивать аккуратно, не используя вортекс, чтобы избежать разрушения клеток дрожжей.
Клетки подвергают тепловому шоку путем помещения в водяную баню при 42 °C на 15 минут с последующим охлаждением на льду в течение 2 минут. Затем клетки собирают с помощью центрифугирования.
Клетки ресуспендируют в дважды дистиллированной воде и высевают на агарные пластины для селекции нужных трансформантов. Пластины для трансформации инкубируют при 30 °C от двух до четырех дней до появления колоний.
До оптимизации процедура трансформации всегда должна включать пластины положительного и отрицательного контроля. Положительный контроль представляет собой суспензию клеток дрожжей с плазмидной ДНК на пластине YPD, не содержащей селективных маркеров; это подтверждает жизнеспособность клеток после процедуры трансформации. Отрицательный контроль представляет собой суспензию клеток дрожжей на соответствующей селективной пластине, например, содержащей антибиотики. На такой пластине не должно быть колоний, что свидетельствует об отсутствии контаминации.
Трансформация дрожжей имеет множество различных областей применения. Одним из таких применений является использование дрожжевой двухгибридной системы для идентификации белков, которые взаимодействуют с интересующим вас белком, или белком-приманкой. Когда плазмида из библиотеки потенциальных партнеров по связыванию, или белков-добычи, трансформируется и происходит взаимодействие, высвобождается транскрипционный фактор, который активирует репортерный ген, такой как Beta-galactosidase. Репортерный ген окрасит колонии, в которых произошло взаимодействие, в синий цвет на чашках, содержащих X-gal — субстрат для бета-галактозидазы.
С помощью метода сексуального циклирования в дрожжах можно создать множественные делеции. Гаплоидные клетки, содержащие репортер и делетированный локус, объединяются в одну клетку путем случайного распределения или мейотической рекомбинации. Для отбора дрожжей, в которых делеции были успешно инкорпорированы, используются селективные маркеры. В данном случае для отбора клеток, экспрессирующих GFP, применяется проточная цитометрия.
Дрожжи могут быть трансформированы белками с флуоресцентной меткой для изучения влияния мутаций на белок-белковые взаимодействия. В данной видеостатье использовалась флуоресцентная микроскопия для изучения влияния различных мутаций на белок-белковые взаимодействия, необходимые для эндоцитоза.
Вы только что посмотрели видео JoVE по трансформации дрожжей. Теперь вы должны понимать основные аспекты строения плазмиды, способы подготовки дрожжевых клеток к трансформации и порядок проведения самой процедуры трансформации. Как всегда, спасибо за просмотр!
View the full transcript and gain access to JoVE Science Education videos
Q1: What is a plasmid and what are its key components?
A plasmid is a small, circular, double-stranded DNA molecule that can supercoil to pass through cell membrane pores. Key components include a multiple cloning site (MCS) where restriction enzymes cut DNA, an origin of replication (ORI) that signals where replication begins, and a selectable marker allowing transformed cells to survive under specific environmental conditions.
Q2: How do yeast cells prepare for transformation?
Yeast cells are prepared by picking a colony from an agar plate and amplifying it in YPD medium overnight at 30°C with agitation. Cells are then pelleted by centrifugation, the supernatant is removed, and pelleted cells are resuspended in buffer or sterile water to create competent cells ready for the transformation procedure. Growth and maintenance of saccharomyces cerevisiae requires careful culture conditions.
Q3: What happens during the lithium acetate transformation method?
Positively-charged lithium cations neutralize charges on the cell membrane and plasmid DNA. Single-stranded DNA binds to the cell wall, leaving plasmid DNA available for uptake. Heat shock at 42°C creates pores allowing DNA entry. When temperature decreases, the cell wall reforms, completing transformation.
Q4: What is the difference between YEp and YCp plasmid vectors?
YEp (yeast episomal plasmid) and YCp (yeast centromeric plasmid) are the most commonly used vectors in yeast transformation. Both contain an autonomous replication sequence (ARS) that enables extrachromosomal replication in yeast. YEp plasmids are non-integrating and replicate as independent elements, while YCp plasmids associate with yeast centromeres.
Q5: Why are positive and negative controls important in yeast transformation?
Positive controls use plasmid DNA on YPD plates without selectable markers to confirm cells remain healthy after transformation. Negative controls use selection plates with no plasmid to verify absence of contamination. These controls validate that the transformation procedure works correctly and results are reliable.
Q6: How does the yeast-two hybrid system identify protein interactions?
Transformed yeast containing prey protein plasmids from a library are screened for interactions with a bait protein. When interaction occurs, a transcription factor activates a reporter gene like beta-galactosidase. Colonies with interactions turn blue on plates containing X-gal substrate, allowing researchers to identify binding partners.
Q7: What are practical applications of yeast transformation in research?
Yeast transformation enables control of gene expression, induction of genetic deletions, expression of recombinant proteins, and labeling of subcellular structures. Researchers use fluorescently-labeled proteins to study mutation effects on protein-protein interactions. Flow cytometry selects cells expressing GFP, and fluorescent microscopy visualizes cellular processes essential for understanding human biology.
Главы в этом видео
0:00
Overview
0:41
Important Aspects of Yeast Transformation
2:42
Principles Behind Yeast Transformation
3:38
Lithium Acetate Transformation Procedure
6:31
Applications
8:04
Summary