Трансформация и клонирование дрожжей

Дрожжи или Saccharomyces cerevisiae представляют собой широко распространенный простой эукариотический модельный организм, используемый в исследованиях в области генетики и клеточной биологии, который позволяет получить представление о клеточных процессах человека. В данном видео рассматривается трансформация — поглощение чужеродной ДНК клеткой дрожжей. Будут представлены плазмиды дрожжей, способы подготовки дрожжевых клеток к трансформации, пошаговая процедура трансформации, а также некоторые области применения этого фундаментального метода.

Прежде чем перейти к трансформации дрожжей, давайте обсудим тип ДНК, используемый при трансформации: плазмиду. Плазмида представляет собой небольшую кольцевую двухцепочечную ДНК, способную к суперспирализации, что позволяет ей легко проходить через поры клеточной мембраны.

Плазмиды содержат полилинкер или MCS (multiple cloning site), в котором рестрикционные эндонуклеазы, также известные как "рестриктазы", могут расщеплять ДНК. Фрагменты ДНК, представляющие интерес и разрезанные теми же ферментами, затем могут быть лигированы в MCS. Плазмиды также содержат точку начала репликации или ORI, которая служит сигналом для клетки о том, где должна начаться репликация. Кроме того, плазмиды имеют селективный маркер, который позволяет клеткам дрожжей, содержащим плазмиду, расти в определенных условиях окружающей среды. Дрожжи, которые не смогли успешно включить плазмиду, не выживут в средах, содержащих селективный маркер. Селективные маркеры могут кодировать гены лекарственной устойчивости или гены ферментов, позволяющих штамму дрожжей синтезировать аминокислоты, которые они иначе не способны производить.

Шаттл-векторы — это плазмиды, которые могут реплицироваться в нескольких видах хозяев. Например, плазмида из E. Coli может расти в дрожжах. Плазмиды дрожжей могут быть неинтегрирующими или интегрирующими; это означает, что плазмида либо объединяется с геномной ДНК, либо остается независимой.

Существует пять основных типов плазмид или векторов, используемых у дрожжей. Два наиболее часто используемых при трансформации дрожжей — это эписомальные плазмиды дрожжей (YEp) и центромерные плазмиды дрожжей (YCp). Оба этих типа векторов содержат последовательность автономной репликации или ARS. ARS содержит точку начала репликации и обеспечивает экстрахромосомную репликацию в дрожжах.

Для трансформации дрожжей можно использовать несколько различных процедур, включая метод сферопластов, электропорацию и трансформацию с использованием ацетата лития. В данном видео мы сосредоточимся на процедуре с применением ацетата лития.

При этом методе трансформации положительно заряженные катионы лития нейтрализуют заряды на клеточной мембране и плазмидной ДНК. Одноцепочечная ДНК, добавляемая в трансформирующую смесь, связывается с клеточной стенкой дрожжей, в результате чего плазмидная ДНК остается доступной для поглощения дрожжевыми клетками. Воздействие резкого повышения температуры, или тепловой шок, создает разницу давлений между внутренней и внешней средами клетки, что приводит к образованию пор, через которые может пройти плазмидная ДНК. При понижении температуры клеточная стенка дрожжей восстанавливается, и процесс трансформации завершается.

Начнем с пошагового описания процедуры подготовки дрожжей к трансформации. Подготовка клеток дрожжей начинается с отбора колонии с агарной пластины и ее амплификации в среде из дрожжевого экстракта, пептона и декстрозы, сокращенно YPD, которая представляет собой полноценную среду для роста дрожжей.

После того как колония отобрана с пластины и помещена в среду YPD, культуру инкубируют в течение ночи при 30 °C с перемешиванием на шейкере или роллере, как показано здесь. Клетки дрожжей осаждают путем центрифугирования, после чего супернатант удаляют. Осажденные клетки ресуспендируют в необходимом буфере или стерильной воде. Эти подготовленные компетентные клетки дрожжей будут использованы в процедуре трансформации.

После подготовки клеток дрожжей можно приступать к трансформации, начав с приготовления трансформационной смеси.

Данная смесь реагентов должна включать: стерильную дистиллированную воду, 50% раствор полиэтиленгликоля (PEG), 1M литий-ацетат, раствор одноцепочечной ДНК в концентрации 10 mg/ml, плазмидную ДНК и компетентные клетки дрожжей. Точные пропорции каждого раствора следует рассчитать перед началом эксперимента, обратившись к стандартному протоколу трансформации дрожжей, принятому в вашей лаборатории.

Затем смесь инкубируют при 30 °C в течение 30 минут при встряхивании. Раствор следует перемешивать аккуратно, не используя вортекс, чтобы избежать разрушения клеток дрожжей.

Клетки подвергают тепловому шоку путем помещения в водяную баню при 42 °C на 15 минут с последующим охлаждением на льду в течение 2 минут. Затем клетки собирают с помощью центрифугирования.

Клетки ресуспендируют в дважды дистиллированной воде и высевают на агарные пластины для селекции нужных трансформантов. Пластины для трансформации инкубируют при 30 °C от двух до четырех дней до появления колоний.

До оптимизации процедура трансформации всегда должна включать пластины положительного и отрицательного контроля. Положительный контроль представляет собой суспензию клеток дрожжей с плазмидной ДНК на пластине YPD, не содержащей селективных маркеров; это подтверждает жизнеспособность клеток после процедуры трансформации. Отрицательный контроль представляет собой суспензию клеток дрожжей на соответствующей селективной пластине, например, содержащей антибиотики. На такой пластине не должно быть колоний, что свидетельствует об отсутствии контаминации.

Трансформация дрожжей имеет множество различных областей применения. Одним из таких применений является использование дрожжевой двухгибридной системы для идентификации белков, которые взаимодействуют с интересующим вас белком, или белком-приманкой. Когда плазмида из библиотеки потенциальных партнеров по связыванию, или белков-добычи, трансформируется и происходит взаимодействие, высвобождается транскрипционный фактор, который активирует репортерный ген, такой как Beta-galactosidase. Репортерный ген окрасит колонии, в которых произошло взаимодействие, в синий цвет на чашках, содержащих X-gal — субстрат для бета-галактозидазы.

С помощью метода сексуального циклирования в дрожжах можно создать множественные делеции. Гаплоидные клетки, содержащие репортер и делетированный локус, объединяются в одну клетку путем случайного распределения или мейотической рекомбинации. Для отбора дрожжей, в которых делеции были успешно инкорпорированы, используются селективные маркеры. В данном случае для отбора клеток, экспрессирующих GFP, применяется проточная цитометрия.

Дрожжи могут быть трансформированы белками с флуоресцентной меткой для изучения влияния мутаций на белок-белковые взаимодействия. В данной видеостатье использовалась флуоресцентная микроскопия для изучения влияния различных мутаций на белок-белковые взаимодействия, необходимые для эндоцитоза.

Вы только что посмотрели видео JoVE по трансформации дрожжей. Теперь вы должны понимать основные аспекты строения плазмиды, способы подготовки дрожжевых клеток к трансформации и порядок проведения самой процедуры трансформации. Как всегда, спасибо за просмотр!