Трансформация и клонирование дрожжей
Дрожжи или Saccharomyces cerevisiae, являются широко распространенными простыми эукариотическими модельными организмами, используемыми в изучении генетики и клеточной биологии, которые могут дать представление о клеточных процессах человека. В этом видео обсуждается трансформация - поглощение чужеродной ДНК дрожжевой клеткой. В нем будут представлены дрожжевые плазмиды, способы подготовки дрожжевых клеток к трансформации, пошаговая процедура трансформации, а также приведены некоторые варианты применения этой фундаментальной техники.
Прежде чем мы поговорим о трансформации дрожжей, давайте сначала обсудим тип ДНК, используемый для трансформации: плазмиду. Плазмида представляет собой маленькую, круглую, двухцепочечную ДНК, которая может легко проходить через поры в клеточной мембране.
Плазмиды содержат сайт множественного клонирования или MCS, где эндонуклеазы рестрикции, также известные как «ферменты рестрикции», могут разрезать ДНК. Фрагменты ДНК, представляющие интерес, разрезанные теми же ферментами, могут быть затем лигированы в MCS. Плазмиды также содержат источник репликации или ORI, который сигнализирует клетке, где должна начаться репликация. Кроме того, плазмиды имеют селективный маркер, который позволяет дрожжевым клеткам, содержащим плазмиду, расти в определенных условиях окружающей среды. Дрожжи, которые не могут успешно внедрить плазмиду, не выживут в средах, содержащих селективный маркер. Выбираемые маркеры могут кодировать гены, которые обеспечивают устойчивость к лекарствам, или гены, которые кодируют ферменты, позволяющие штамму дрожжей синтезировать аминокислоты, которые они в противном случае не могут производить.
Челночные векторы — это плазмиды, которые могут реплицироваться более чем у одного вида-хозяина. Например, плазмида из E. coli может расти в дрожжах. Дрожжевые плазмиды могут быть неинтегрирующими или интегрирующимися, что означает, что плазмида либо соединяется с геномной ДНК, либо остается независимой.
Существует пять различных основных типов плазмид или векторов, которые используются в дрожжах. Две, которые чаще всего используются в трансформации дрожжей, — это дрожжевая эписомальная плазмида или YEp и дрожжевая центрометическая плазмида или YCp. Оба этих типа векторов содержат последовательность автономной репликации или ARS. ARS содержит источник репликации и обеспечивает внехромосомную репликацию у дрожжей.
Существует несколько различных процедур, которые могут быть использованы для трансформации дрожжей, включая метод сферопластов, электропорацию и превращение в ацетат лития. В этом видео мы сосредоточимся на процедуре с ацетатом лития.
В этом методе трансформации положительно заряженные катионы лития нейтрализуют заряды на клеточной мембране и плазмидной ДНК Одноцепочечная ДНК, добавленная в трансформационную смесь, связывается с клеточной стенкой дрожжей и оставляет плазмидную ДНК доступной для поглощения дрожжевыми клетками. Воздействие внезапного повышения температуры или теплового шока создает разницу давлений между внутренней и внешней клеткой, создавая поры, через которые может проходить плазмидная ДНК. Когда температура снижается, клеточная стенка дрожжей восстанавливается и трансформация завершается.
Начнем с пошаговой процедуры, как подготовить дрожжи к трансформации. Дрожжевые клетки должны быть подготовлены путем предварительного забора колонии из агаровой пластины и амплификации колонии в дрожжевой экстракт пептона декстрозы средой, сокращенно YPD - полноценной средой для роста дрожжей.
После того, как колония собрана с тарелки и помещена в среду YPD, культуру инкубируют в течение ночи при температуре 30 °C с перемешиванием на вибростенде или роликовом аппарате, как вы видите здесь. Дрожжевые клетки гранулируются центрифугированием, а супернант удаляется. Гранулированные клетки ресуспендируются с помощью буфера или стерильной воды. Эти грамотно подготовленные дрожжевые клетки будут использованы в процедуре трансформации.
После того, как дрожжевые клетки подготовлены, можно провести трансформацию, предварительно приготовив трансформационную смесь.
В состав этой смеси реагентов должны входить: стерильная дистиллированная вода; раствор 50% полиэтиленгликоля или ПЭГ, 1М ацетата лития, 10 мг/мл раствора одноцепочечной ДНК, плазмидной ДНК и компетентных дрожжевых клеток. Точные пропорции каждого раствора должны быть рассчитаны до начала эксперимента, сверившись со стандартным протоколом трансформации дрожжей в вашей лаборатории.
Затем смесь инкубируют при 30 °C в течение 30 минут с встряхиванием. Раствор должен быть смешанным, а не вихревым, чтобы дрожжевые клетки не распались.
Ячейки подвергаются тепловому шоку путем помещения в водяную баню при температуре 42 °C на 15 минут с последующим охлаждением на льду в течение 2 минут. Затем клетки собирают методом центрифугирования.
Ячейки ресуспендируются в воде двойной дистилляции и помещаются на агаровые пластины, которые отбирают желаемые трансформаторы. Затем трансформационные планшеты инкубируют при 30 °C в течение двух-четырех дней до тех пор, пока не сформируются колонии.
Процедуры трансформации всегда должны включать положительные и отрицательные контрольные пластины до тех пор, пока они не будут оптимизированы. Положительным контролем должна быть суспензия дрожжевых клеток с плазмидной ДНК на планшете YPD, который не содержит какого-либо селективного маркера. Это показывает, что клетки здоровы после процедуры трансформации. Отрицательная контрольная пластина должна представлять собой суспензию дрожжевых клеток на соответствующей селекционной пластине, например, содержащей антибиотики. Пластина не должна иметь колоний и показывает, что нет загрязнения.
Существует множество различных применений для трансформации дрожжей. Одним из применений трансформированных дрожжей является использование гибридной системы дрожжей и двух дрожжей для идентификации белков, которые взаимодействуют с интересующим вас белком или белком-приманкой. Когда плазмида из библиотеки потенциальных партнеров по связыванию, или белков добычи, трансформируется и происходит взаимодействие, высвобождается транскрипционный фактор, который активирует репортерный ген, такой как бета-галактозидаза. Репортерный ген окрашивает колонии, которые имеют взаимодействие, в синий цвет на пластинах, содержащих X-gal — субстрат для бета-галадосидазы.
Множественные делеции могут быть спроектированы в дрожжах с помощью техники с использованием сексуального цикла. Гаплоидные клетки, содержащие репортер и удаленный локус, объединяются в одну клетку путем случайной сортировки или мейотической рекомбинации. Выбираемые маркеры используются для отбора дрожжей, которые успешно внедрили делеции. В этом случае проточная цитометрия используется для отбора клеток, экспрессирующих GFP.
Дрожжи могут быть преобразованы с помощью белков, которые флуоресцентно помечены, чтобы увидеть влияние мутаций на белок-белковые взаимодействия. В этой видеостатье с помощью флуоресцентной микроскопии изучалось влияние различных мутаций на белок-белковые взаимодействия, необходимые для эндоцитоза.
Вы только что посмотрели видео JoVE о трансформации дрожжей. Теперь вы должны понять основные аспекты плазмиды, как подготовить дрожжевые клетки к трансформации и как выполнять процедуру трансформации. Как всегда, спасибо за просмотр!
S. cerevisiae — это одноклеточные эукариоты, которые являются широко используемыми модельными организмами в биологических исследованиях. В ходе своей…
Дрожжи или Saccharomyces cerevisiae, являются широко распространенными простыми эукариотическими модельными организмами, используемыми в изучении генетики и клеточной биологии, которые могут дать представление о клеточных процессах человека. В этом видео обсуждается трансформация - поглощение чужеродной ДНК дрожжевой клеткой. В нем будут представлены дрожжевые плазмиды, способы подготовки дрожжевых клеток к трансформации, пошаговая процедура трансформации, а также приведены некоторые варианты применения этой фундаментальной техники.
Прежде чем мы поговорим о трансформации дрожжей, давайте сначала обсудим тип ДНК, используемый для трансформации: плазмиду. Плазмида представляет собой маленькую, круглую, двухцепочечную ДНК, которая может легко проходить через поры в клеточной мембране.
Плазмиды содержат сайт множественного клонирования или MCS, где эндонуклеазы рестрикции, также известные как «ферменты рестрикции», могут разрезать ДНК. Фрагменты ДНК, представляющие интерес, разрезанные теми же ферментами, могут быть затем лигированы в MCS. Плазмиды также содержат источник репликации или ORI, который сигнализирует клетке, где должна начаться репликация. Кроме того, плазмиды имеют селективный маркер, который позволяет дрожжевым клеткам, содержащим плазмиду, расти в определенных условиях окружающей среды. Дрожжи, которые не могут успешно внедрить плазмиду, не выживут в средах, содержащих селективный маркер. Выбираемые маркеры могут кодировать гены, которые обеспечивают устойчивость к лекарствам, или гены, которые кодируют ферменты, позволяющие штамму дрожжей синтезировать аминокислоты, которые они в противном случае не могут производить.
Челночные векторы — это плазмиды, которые могут реплицироваться более чем у одного вида-хозяина. Например, плазмида из E. coli может расти в дрожжах. Дрожжевые плазмиды могут быть неинтегрирующими или интегрирующимися, что означает, что плазмида либо соединяется с геномной ДНК, либо остается независимой.
Существует пять различных основных типов плазмид или векторов, которые используются в дрожжах. Две, которые чаще всего используются в трансформации дрожжей, — это дрожжевая эписомальная плазмида или YEp и дрожжевая центрометическая плазмида или YCp. Оба этих типа векторов содержат последовательность автономной репликации или ARS. ARS содержит источник репликации и обеспечивает внехромосомную репликацию у дрожжей.
Существует несколько различных процедур, которые могут быть использованы для трансформации дрожжей, включая метод сферопластов, электропорацию и превращение в ацетат лития. В этом видео мы сосредоточимся на процедуре с ацетатом лития.
В этом методе трансформации положительно заряженные катионы лития нейтрализуют заряды на клеточной мембране и плазмидной ДНК Одноцепочечная ДНК, добавленная в трансформационную смесь, связывается с клеточной стенкой дрожжей и оставляет плазмидную ДНК доступной для поглощения дрожжевыми клетками. Воздействие внезапного повышения температуры или теплового шока создает разницу давлений между внутренней и внешней клеткой, создавая поры, через которые может проходить плазмидная ДНК. Когда температура снижается, клеточная стенка дрожжей восстанавливается и трансформация завершается.
Начнем с пошаговой процедуры, как подготовить дрожжи к трансформации. Дрожжевые клетки должны быть подготовлены путем предварительного забора колонии из агаровой пластины и амплификации колонии в дрожжевой экстракт пептона декстрозы средой, сокращенно YPD - полноценной средой для роста дрожжей.
После того, как колония собрана с тарелки и помещена в среду YPD, культуру инкубируют в течение ночи при температуре 30 °C с перемешиванием на вибростенде или роликовом аппарате, как вы видите здесь. Дрожжевые клетки гранулируются центрифугированием, а супернант удаляется. Гранулированные клетки ресуспендируются с помощью буфера или стерильной воды. Эти грамотно подготовленные дрожжевые клетки будут использованы в процедуре трансформации.
После того, как дрожжевые клетки подготовлены, можно провести трансформацию, предварительно приготовив трансформационную смесь.
В состав этой смеси реагентов должны входить: стерильная дистиллированная вода; раствор 50% полиэтиленгликоля или ПЭГ, 1М ацетата лития, 10 мг/мл раствора одноцепочечной ДНК, плазмидной ДНК и компетентных дрожжевых клеток. Точные пропорции каждого раствора должны быть рассчитаны до начала эксперимента, сверившись со стандартным протоколом трансформации дрожжей в вашей лаборатории.
Затем смесь инкубируют при 30 °C в течение 30 минут с встряхиванием. Раствор должен быть смешанным, а не вихревым, чтобы дрожжевые клетки не распались.
Ячейки подвергаются тепловому шоку путем помещения в водяную баню при температуре 42 °C на 15 минут с последующим охлаждением на льду в течение 2 минут. Затем клетки собирают методом центрифугирования.
Ячейки ресуспендируются в воде двойной дистилляции и помещаются на агаровые пластины, которые отбирают желаемые трансформаторы. Затем трансформационные планшеты инкубируют при 30 °C в течение двух-четырех дней до тех пор, пока не сформируются колонии.
Процедуры трансформации всегда должны включать положительные и отрицательные контрольные пластины до тех пор, пока они не будут оптимизированы. Положительным контролем должна быть суспензия дрожжевых клеток с плазмидной ДНК на планшете YPD, который не содержит какого-либо селективного маркера. Это показывает, что клетки здоровы после процедуры трансформации. Отрицательная контрольная пластина должна представлять собой суспензию дрожжевых клеток на соответствующей селекционной пластине, например, содержащей антибиотики. Пластина не должна иметь колоний и показывает, что нет загрязнения.
Существует множество различных применений для трансформации дрожжей. Одним из применений трансформированных дрожжей является использование гибридной системы дрожжей и двух дрожжей для идентификации белков, которые взаимодействуют с интересующим вас белком или белком-приманкой. Когда плазмида из библиотеки потенциальных партнеров по связыванию, или белков добычи, трансформируется и происходит взаимодействие, высвобождается транскрипционный фактор, который активирует репортерный ген, такой как бета-галактозидаза. Репортерный ген окрашивает колонии, которые имеют взаимодействие, в синий цвет на пластинах, содержащих X-gal — субстрат для бета-галадосидазы.
Множественные делеции могут быть спроектированы в дрожжах с помощью техники с использованием сексуального цикла. Гаплоидные клетки, содержащие репортер и удаленный локус, объединяются в одну клетку путем случайной сортировки или мейотической рекомбинации. Выбираемые маркеры используются для отбора дрожжей, которые успешно внедрили делеции. В этом случае проточная цитометрия используется для отбора клеток, экспрессирующих GFP.
Дрожжи могут быть преобразованы с помощью белков, которые флуоресцентно помечены, чтобы увидеть влияние мутаций на белок-белковые взаимодействия. В этой видеостатье с помощью флуоресцентной микроскопии изучалось влияние различных мутаций на белок-белковые взаимодействия, необходимые для эндоцитоза.
Вы только что посмотрели видео JoVE о трансформации дрожжей. Теперь вы должны понять основные аспекты плазмиды, как подготовить дрожжевые клетки к трансформации и как выполнять процедуру трансформации. Как всегда, спасибо за просмотр!
Дрожжи или Saccharomyces cerevisiae, являются широко распространенными простыми эукариотическими модельными организмами, используемыми в изучении генетики и клеточной биологии, которые могут дать представление о клеточных процессах человека. В этом видео обсуждается трансформация - поглощение чужеродной ДНК дрожжевой клеткой. В нем будут представлены дрожжевые плазмиды, способы подготовки дрожжевых клеток к трансформации, пошаговая процедура трансформации, а также приведены некоторые варианты применения этой фундаментальной техники.
Прежде чем мы поговорим о трансформации дрожжей, давайте сначала обсудим тип ДНК, используемый для трансформации: плазмиду. Плазмида представляет собой маленькую, круглую, двухцепочечную ДНК, которая может легко проходить через поры в клеточной мембране.
Плазмиды содержат сайт множественного клонирования или MCS, где эндонуклеазы рестрикции, также известные как «ферменты рестрикции», могут разрезать ДНК. Фрагменты ДНК, представляющие интерес, разрезанные теми же ферментами, могут быть затем лигированы в MCS. Плазмиды также содержат источник репликации или ORI, который сигнализирует клетке, где должна начаться репликация. Кроме того, плазмиды имеют селективный маркер, который позволяет дрожжевым клеткам, содержащим плазмиду, расти в определенных условиях окружающей среды. Дрожжи, которые не могут успешно внедрить плазмиду, не выживут в средах, содержащих селективный маркер. Выбираемые маркеры могут кодировать гены, которые обеспечивают устойчивость к лекарствам, или гены, которые кодируют ферменты, позволяющие штамму дрожжей синтезировать аминокислоты, которые они в противном случае не могут производить.
Челночные векторы — это плазмиды, которые могут реплицироваться более чем у одного вида-хозяина. Например, плазмида из E. coli может расти в дрожжах. Дрожжевые плазмиды могут быть неинтегрирующими или интегрирующимися, что означает, что плазмида либо соединяется с геномной ДНК, либо остается независимой.
Существует пять различных основных типов плазмид или векторов, которые используются в дрожжах. Две, которые чаще всего используются в трансформации дрожжей, — это дрожжевая эписомальная плазмида или YEp и дрожжевая центрометическая плазмида или YCp. Оба этих типа векторов содержат последовательность автономной репликации или ARS. ARS содержит источник репликации и обеспечивает внехромосомную репликацию у дрожжей.
Существует несколько различных процедур, которые могут быть использованы для трансформации дрожжей, включая метод сферопластов, электропорацию и превращение в ацетат лития. В этом видео мы сосредоточимся на процедуре с ацетатом лития.
В этом методе трансформации положительно заряженные катионы лития нейтрализуют заряды на клеточной мембране и плазмидной ДНК Одноцепочечная ДНК, добавленная в трансформационную смесь, связывается с клеточной стенкой дрожжей и оставляет плазмидную ДНК доступной для поглощения дрожжевыми клетками. Воздействие внезапного повышения температуры или теплового шока создает разницу давлений между внутренней и внешней клеткой, создавая поры, через которые может проходить плазмидная ДНК. Когда температура снижается, клеточная стенка дрожжей восстанавливается и трансформация завершается.
Начнем с пошаговой процедуры, как подготовить дрожжи к трансформации. Дрожжевые клетки должны быть подготовлены путем предварительного забора колонии из агаровой пластины и амплификации колонии в дрожжевой экстракт пептона декстрозы средой, сокращенно YPD - полноценной средой для роста дрожжей.
После того, как колония собрана с тарелки и помещена в среду YPD, культуру инкубируют в течение ночи при температуре 30 °C с перемешиванием на вибростенде или роликовом аппарате, как вы видите здесь. Дрожжевые клетки гранулируются центрифугированием, а супернант удаляется. Гранулированные клетки ресуспендируются с помощью буфера или стерильной воды. Эти грамотно подготовленные дрожжевые клетки будут использованы в процедуре трансформации.
После того, как дрожжевые клетки подготовлены, можно провести трансформацию, предварительно приготовив трансформационную смесь.
В состав этой смеси реагентов должны входить: стерильная дистиллированная вода; раствор 50% полиэтиленгликоля или ПЭГ, 1М ацетата лития, 10 мг/мл раствора одноцепочечной ДНК, плазмидной ДНК и компетентных дрожжевых клеток. Точные пропорции каждого раствора должны быть рассчитаны до начала эксперимента, сверившись со стандартным протоколом трансформации дрожжей в вашей лаборатории.
Затем смесь инкубируют при 30 °C в течение 30 минут с встряхиванием. Раствор должен быть смешанным, а не вихревым, чтобы дрожжевые клетки не распались.
Ячейки подвергаются тепловому шоку путем помещения в водяную баню при температуре 42 °C на 15 минут с последующим охлаждением на льду в течение 2 минут. Затем клетки собирают методом центрифугирования.
Ячейки ресуспендируются в воде двойной дистилляции и помещаются на агаровые пластины, которые отбирают желаемые трансформаторы. Затем трансформационные планшеты инкубируют при 30 °C в течение двух-четырех дней до тех пор, пока не сформируются колонии.
Процедуры трансформации всегда должны включать положительные и отрицательные контрольные пластины до тех пор, пока они не будут оптимизированы. Положительным контролем должна быть суспензия дрожжевых клеток с плазмидной ДНК на планшете YPD, который не содержит какого-либо селективного маркера. Это показывает, что клетки здоровы после процедуры трансформации. Отрицательная контрольная пластина должна представлять собой суспензию дрожжевых клеток на соответствующей селекционной пластине, например, содержащей антибиотики. Пластина не должна иметь колоний и показывает, что нет загрязнения.
Существует множество различных применений для трансформации дрожжей. Одним из применений трансформированных дрожжей является использование гибридной системы дрожжей и двух дрожжей для идентификации белков, которые взаимодействуют с интересующим вас белком или белком-приманкой. Когда плазмида из библиотеки потенциальных партнеров по связыванию, или белков добычи, трансформируется и происходит взаимодействие, высвобождается транскрипционный фактор, который активирует репортерный ген, такой как бета-галактозидаза. Репортерный ген окрашивает колонии, которые имеют взаимодействие, в синий цвет на пластинах, содержащих X-gal — субстрат для бета-галадосидазы.
Множественные делеции могут быть спроектированы в дрожжах с помощью техники с использованием сексуального цикла. Гаплоидные клетки, содержащие репортер и удаленный локус, объединяются в одну клетку путем случайной сортировки или мейотической рекомбинации. Выбираемые маркеры используются для отбора дрожжей, которые успешно внедрили делеции. В этом случае проточная цитометрия используется для отбора клеток, экспрессирующих GFP.
Дрожжи могут быть преобразованы с помощью белков, которые флуоресцентно помечены, чтобы увидеть влияние мутаций на белок-белковые взаимодействия. В этой видеостатье с помощью флуоресцентной микроскопии изучалось влияние различных мутаций на белок-белковые взаимодействия, необходимые для эндоцитоза.
Вы только что посмотрели видео JoVE о трансформации дрожжей. Теперь вы должны понять основные аспекты плазмиды, как подготовить дрожжевые клетки к трансформации и как выполнять процедуру трансформации. Как всегда, спасибо за просмотр!
View the full transcript and gain access to JoVE Science Education videos
Q1: What is a plasmid and what are its key components?
A plasmid is a small, circular, double-stranded DNA molecule that can supercoil to pass through cell membrane pores. Key components include a multiple cloning site (MCS) where restriction enzymes cut DNA, an origin of replication (ORI) that signals where replication begins, and a selectable marker allowing transformed cells to survive under specific environmental conditions.
Q2: How do yeast cells prepare for transformation?
Yeast cells are prepared by picking a colony from an agar plate and amplifying it in YPD medium overnight at 30°C with agitation. Cells are then pelleted by centrifugation, the supernatant is removed, and pelleted cells are resuspended in buffer or sterile water to create competent cells ready for the transformation procedure. Growth and maintenance of saccharomyces cerevisiae requires careful culture conditions.
Q3: What happens during the lithium acetate transformation method?
Positively-charged lithium cations neutralize charges on the cell membrane and plasmid DNA. Single-stranded DNA binds to the cell wall, leaving plasmid DNA available for uptake. Heat shock at 42°C creates pores allowing DNA entry. When temperature decreases, the cell wall reforms, completing transformation.
Q4: What is the difference between YEp and YCp plasmid vectors?
YEp (yeast episomal plasmid) and YCp (yeast centromeric plasmid) are the most commonly used vectors in yeast transformation. Both contain an autonomous replication sequence (ARS) that enables extrachromosomal replication in yeast. YEp plasmids are non-integrating and replicate as independent elements, while YCp plasmids associate with yeast centromeres.
Q5: Why are positive and negative controls important in yeast transformation?
Positive controls use plasmid DNA on YPD plates without selectable markers to confirm cells remain healthy after transformation. Negative controls use selection plates with no plasmid to verify absence of contamination. These controls validate that the transformation procedure works correctly and results are reliable.
Q6: How does the yeast-two hybrid system identify protein interactions?
Transformed yeast containing prey protein plasmids from a library are screened for interactions with a bait protein. When interaction occurs, a transcription factor activates a reporter gene like beta-galactosidase. Colonies with interactions turn blue on plates containing X-gal substrate, allowing researchers to identify binding partners.
Q7: What are practical applications of yeast transformation in research?
Yeast transformation enables control of gene expression, induction of genetic deletions, expression of recombinant proteins, and labeling of subcellular structures. Researchers use fluorescently-labeled proteins to study mutation effects on protein-protein interactions. Flow cytometry selects cells expressing GFP, and fluorescent microscopy visualizes cellular processes essential for understanding human biology.
Главы в этом видео
0:00
Overview
0:41
Important Aspects of Yeast Transformation
2:42
Principles Behind Yeast Transformation
3:38
Lithium Acetate Transformation Procedure
6:31
Applications
8:04
Summary