Содержание Drosophila

Успех исследований на Drosophila melanogaster зависит от правильного содержания и разведения этого ценного модельного организма. В следующем видео будут рассмотрены необходимые шаги по обеспечению надлежащего питания, условий размещения и правил обращения с мухами.

Хотя Drosophila melanogaster обычно называют плодовым мушками, на самом деле они питаются микроорганизмами, такими как дрожжи, которые растут на ферментирующих фруктах. В лабораторных условиях рацион мушек модифицируют в практических целях. Существует несколько рецептов, и все они содержат основные компоненты: сахар и дрожжи. Следующий рецепт предоставлен Университетом Индианы в Блумингтоне, известным своим огромным разнообразием линий мушек. Он состоит из: стерильной воды, дрожжей, соевой муки, желтой кукурузной крупы, агара для создания текстуры, кукурузного сиропа и пропионовой кислоты для подавления роста плесени и бактерий. Эти ингредиенты смешивают, нагревают, перемешивают, а затем распределяют по пластиковым флаконам для содержания с помощью помпы. После заполнения флаконы закрывают хлопковыми пробками, оборачивают и охлаждают при 4 °C. После затвердевания корм стерилизуют в автоклаве.

Теперь, когда мы немного узнали о рационе питания мух, давайте разберем, где они живут и как с ними работают.

Для содержания мух используются различные типы контейнеров. Пробирки применяются для поддержания популяций и оптимально вмещают 50-100 взрослых особей. Бутыли используются для более крупных культур и вмещают 300-600 взрослых мух. Инкубаторы контролируют условия окружающей среды и способны вмещать сотни пробирок и бутылей. Стандартные условия содержания мух: 25 °C и относительная влажность 60-65%.

При работе с мухами важно соблюдать правила маркировки и документирования, а также поддерживать чистоту окружающей среды для обеспечения чистоты линий мух и достоверности экспериментов. Контейнер необходимо заменить, когда примерно половина куколок прошла через стадию эклозии, то есть покинула куколочную оболочку. Оболочки в этом случае становятся прозрачными.

Для справки: стадия куколки наступает между личиночной и имагинальной стадиями; в это время личинки инкубируются и развиваются во взрослую особь. Чтобы определить, стала ли оболочка куколки прозрачной, поднесите контейнер к источнику света и осмотрите куколку.

Мухи переносятся в пробирки со свежей средой — так официально называется корм для мух — с помощью процесса, известного как "перекладывание мух" (flipping flies). Перед перекладыванием проверьте целостность среды. Мухи не могут выжить на корме, который потрескался от сухости или загрязнен плесенью или бактериями.

Чтобы переложить мух, сначала осторожно постучите пробиркой по поверхности стола, чтобы мухи отделились от стенок. Затем быстро снимите пробку и стремительно переверните мух из старого контейнера в новый. Этот процесс выполняется быстро, чтобы предотвратить побег мух или их раздавливание пробкой, а также чтобы исключить попадание посторонних мух в пробирку во время перекладывания.

Хотя переворачивание пробирок является предпочтительным методом для массового переноса Drosophila, для сортировки мух необходима анестезия. Здесь будут рассмотрены два метода анестезии: охлаждение и использование углекислого газа. Для охлаждения мух поместите культуру в морозильную камеру при -20 °C на 8-12 минут. Затем перенесите мух на охлажденную плоскую рабочую поверхность для отбора. Мух также можно анестезировать холодом, охлаждая их непосредственно на замороженной поверхности.

Углекислый газ является предпочтительным методом анестезии, так как он не вызывает острой летальности у мух и не представляет опасности для исследователя. Система подачи CO2 состоит из: баллона с CO2; трубки, подключенной к игле, для анестезии мух в пробирках и флаконах; и трубки, подключенной к CO2-пластине для анализа под микроскопом.

Для анестезии мух введите иглу с CO2 через пробку. В качестве альтернативы постучите контейнером по поверхности, снимите пробку и быстро высыпьте мух на CO2-пластину, сохраняя герметичность до тех пор, пока мухи не станут неподвижными. С помощью кисточки или пинцета осторожно переместите мух в новый контейнер.

Для удаления ненужных мух слейте их в «морг» для мух, который представляет собой большой флакон, наполненный изопропанолом или этанолом и минеральным маслом, закрытый сверху воронкой.

Теперь, когда мы ознакомились с тем, как поддерживают и используют мух в лаборатории, давайте рассмотрим, как модифицируются условия содержания и кормления для различных экспериментов.

Некоторые эксперименты требуют альтернативных условий содержания, чтобы можно было удерживать большее количество мух.

В данном эксперименте исследователь использует клетку для популяций мух, чтобы собрать большое количество эмбрионов. Клетка для популяций мух представляет собой прозрачный пластиковый бокс, способный вместить тысячи мух. Исследователь выпускает нужных мух из нескольких флаконов в клетку, затем помещает в клетку чашки с агаром для сбора эмбрионов.

Некоторые эксперименты требуют манипуляций с рационом питания мух.

В этом эксперименте исследователь хочет наблюдать за реакцией избегания трансгенных мух, экспрессирующих светозависимый ионный канал в нейронах, которые регулируют реакцию избегания у мух. Рацион Drosophila дополняется "all-trans-retinal", который является кофактором этого канала и обеспечивает его функционирование. Это делается путем расплавления корма и добавления реагента. Затем муху подвергают воздействию синего света, который активирует канал и вызывает реакцию избегания, после чего измеряется время, затраченное на полет.

Для проведения экспериментов можно варьировать различные условия содержания и обращения.

В этом эксперименте создается сложная установка "power tower" (силовая башня) для изучения влияния физических нагрузок на Drosophila. «Силовая башня» — это устройство, которое постоянно поднимается и опускается, используя естественную реакцию мухи перемещаться вверх, против силы тяжести, что известно как "отрицательный геотаксис."

Показатели мух, подвергавшихся нагрузкам в «силовой башне», измеряются с помощью теста на быстрый итеративный отрицательный геотаксис (Rapid Iterative Negative Geotaxis assay), или сокращенно RING-теста. Мух в пустых пробирках помещают перед камерой. По пробиркам постукивают, и записывается дистанция подъема. Этот эксперимент показывает, что по сравнению с контрольной группой физические нагрузки оказали положительное влияние на активность с течением времени.

В данном видео JoVE были рассмотрены вопросы содержания и разведения Drosophila melanogaster. После просмотра этого видео вы сможете самостоятельно готовить питательные среды для мух, правильно подбирать условия их содержания, пересаживать мух и проводить простые эксперименты. Благодарим за просмотр!