Процедуры выявления инфекционных прионов после прохождения через пищеварительный тракт птичьего видов

Общая цель этой процедуры заключается в том, чтобы задокументировать прохождение инфекционного материала PreOn через пищеварительную систему американских ворон. Для этого сначала измеряют ворон инфекционным материалом PreOn. Второй шаг заключается в сборе вороньих фекалий в течение четырех часов после зонда и подготовке их к введению мышам.

Далее мышам вводят внутрибрюшинный ввод одного миллилитра гомогената вороньих фекалий. Последним шагом является ежедневное наблюдение за мышами до тех пор, пока у них не появятся клинические признаки мышиной царапины. В конечном счете, вестерн-блоттинг используется для подтверждения наличия инфекционного PreOn в мышиной модели и проверки передачи заболевания.

Идея о том, что вороны могут передвигаться. CWD пришла к нам одним зимним днем, когда после поездки на ферму по разведению лосей в неволе, где мы проводили некоторые исследования, и увидели, как вороны кормятся на дорогах, а позже в тот же день вороны выходят из неба из ниоткуда, приземляются в эти кормушки, кормятся прямо рядом с лосем, испражняются на зерно, которое потребляли лось, это в дополнение к наблюдениям из литературы, которые многие из Этим летом по всему Колорадо, Вайомингу зимуют в концентрированной области в Нью-Мексико, так уж получилось, что именно в этой области в Нью-Мексико появилось некоторое АКШ, и она находится в сотне миль в сотнях миль от эпицентра болезни истощения крэка. Эти два наблюдения заставили нас задуматься о том, что потенциально вороны могут играть роль в переносе CWD по ландшафту.

Визуальная демонстрация этих методов имеет решающее значение, поскольку неправильная техника внутрибрюшинного и орального зондирования может привести к смерти исследуемых животных. Для начала добавьте четыре капли синего красителя в яичницу и хорошо перемешайте. Затем наберите пять миллилитров смеси красителя и яйца в двухдюймовую иглу для зондажа, при этом один человек осторожно удерживает ворону.

Откройте клюв вороны достаточно широко, чтобы видеть ее горло, и осторожно введите иглу для зонда в ее пищевод. Если вы заметили какие-либо изменения в дыхании, извлеките шприц и повторите попытку, так как он мог быть помещен в трахею. Как только вы убедитесь, что игла для зондирования находится в пищеводе, медленно сцедите содержимое шприца.

Проверяйте ворону каждые 30 минут до тех пор, пока иссине-зеленые фекалии не перестанут выделяться. Тестовым воронам потребовалось около четырех часов, чтобы перестать выделять фекалии, окрашенные в синий цвет. Затем добавьте одну часть незараженного C 57 черного шести мозга мыши к четырем частям стерильного PBS и несколько стеклянных шариков в пулеобразный блендер.

Гомогенизатор гомогенизирует образец в течение одной-пяти минут до достижения однородной консистенции. Повторите процесс, используя неизлечимо больной штамм R ML Chandler, зараженный C 57 черной шестеркой мышиного мозга. Затем центрифугируйте однородное вещество при 3000 умноженных на G в течение одной минуты.

Для удаления более крупных твердых частиц. Затем удалите надосадочную жидкость и разбавьте ее равным объемом стерильного XPBS, чтобы получить 10% веса на объем мозгового вещества. В PBS образцы хранятся при температуре минус 80 градусов Цельсия до тех пор, пока они не понадобятся за 17 часов до зондирования.

Убирайте еду, но не воду из загонов для ворон. Случайным образом распределите ворон по группам лечения и перорально измерьте каждую ворону пятью миллилитрами только что оттаявшего, нормального или инфицированного гомогената мозга мышей с помощью двухдюймовой иглы для зондажа. Затем пересадите ворон в отдельные клетки.

Соберите и объедините все фекалии в каждой клетке через четыре часа после зонда. Затем гомогенизируйте собранные фекалии для каждой вороны в гомогенизаторе синей пули со стеклянными шариками до получения однородной текстуры. Затем берут 500 микролитров смеси и разводят ее один к 20 с 9,5 миллилитрами стерильной центрифуги PBS, разведенным фекальным гомогенатом в течение 15 минут.

Добавьте 1 300 раз G и затем переложите надосадочную жидкость в свежую трубку. Чтобы свести к минимуму угрозу вторичной микробной инфекции, добавьте одну единицу пенициллина и один микрограмм стрептомицина на миллилитр гомогената. Затем обрабатывайте образцы ультразвуком в аторе с разрешением 3000 МП при мощности 70 в течение 30 секунд, чтобы нарушить мембрану любых оставшихся микробов.

Во-первых, случайным образом распределите мышей по одной из четырех показанных здесь групп. Первая группа будет получать зараженные вороньи фекалии. Вторая группа будет получать неинфицированные вороньи фекалии.

Третья группа получит инфицированный мозг мыши, а четвертая группа — нормальный мозг мыши. Затем для первой и второй групп MN наберите по одному миллилитру соскобного положительного или скребкового отрицательного кала вороны. Гомогенировать с помощью иглы 25 калибра в соответствии с номером группы мыши.

Затем потрепайте мышь за спинную часть ее шеи. С помощью большого и указательного пальцев аккуратно поверните ее, чтобы обнажить брюшную сторону. Поднимите задний конец мыши так, чтобы ее голова была немного ниже.

Введите иглу на один сантиметр через кожу, на один сантиметр в сторону средней линии и на один-два сантиметра впереди крестцово-подвздошного сустава. Затем слегка оттяните назад и медленно введите однородное вещество в полость тела мыши. Затем подготовьте гомогенат замороженного мышиного мозга с обрывком и без него для введения животным в третьей и четвертой группах.

Сначала разбавляя поголовья смесей один к 10 стерильным ПБС. Затем введите один миллилитр разбавленного соскобительно-положительного гомогената мозга мышам третьей группы и один миллилитр разбавленного скребково-отрицательного гомогената мозга мышам. В четвертой группе.

Ежедневно наблюдайте за мышами до тех пор, пока у них не появятся клинические признаки мышиной царапины. Клинические признаки могут включать кифоз, атаку, ригидность хвоста, отсутствие груминга, истощение и вялость. Ежедневно оценивайте каждый из шести клинических признаков.

Когда заметны видимые признаки. Ноль означает отсутствие видимых признаков. Один равен умеренному, а два – серьезному уровню знака.

Усыпляйте мышей, когда общее количество ежедневных баллов по каждому признаку достигает более или равных восьми в течение одного дня больше или равно шести непрерывно в течение трех дней или через 365 дней. После прививки соберите мозги сразу после эвтаназии и храните их при температуре минус 80 градусов по Цельсию. Затем правильно утилизируйте туши, чтобы подтвердить обрывочный диагноз.

Разморозьте замороженные мозги мышей и индивидуально гомогенизируйте их в гомогенизаторе с голубой пулей со стеклянными шариками до получения однородной текстуры. Затем приготовьте 125 микролитров раствора для расщепления протеиназы К, соединив 109,39 микролитров PBS с 12,5 микролитрами 500 миллимолярных ЭДТА при pH 8 и 3,1 микролитрами раствора протеиназы К с концентрацией 50 микрограмм на миллилитр. Затем добавьте три микролитра пищеварительного раствора на 17 микролитров мозга. Гомогенизировать.

Инкубируйте образцы при температуре 45 градусов Цельсия на встряхивающем термоблоке в течение 30 минут. После завершения инкубации инактивируйте раствор для разложения, добавив восемь микролитров буфера загрузки страниц SDS, и инкубируйте образцы при температуре 95 градусов Цельсия в течение пяти минут. Затем загрузите образцы на страницу с 12% SDS.

Гель электрофорез белков и перенос геля на мембрану IMON PVDF После переноса заблокируйте мембрану PVDF 5% обезжиренного молока в PBS с содержанием 0,2% от 20 и камни на один час при комнатной температуре. Затем зондируют мембрану с помощью заимствования 224 и моноклонального антитела IPRP, конъюгированного с пероксидазой хрена, разведенной от одного до 20 000 в суперблоке и камне в течение одного часа при комнатной температуре после инкубации. Промойте мембрану в течение одного часа в PBS с концентрацией 0,2% от 20.

Визуализируйте белки, инкубируя мембрану с хемилюминесцентным субстратом в течение пяти минут. Затем визуализация мембраны на системе документирования геля G box. Больные мыши были идентифицированы по проявлению клинических признаков соскобливания мышей, а подтверждение заболевания было завершено с помощью западного анализа крови.

Нормальный мозг мыши, однородный, без царапин, показаны здесь в левой полосе с помощью и без помощи протеазы К. Без протеазы К видны три изгиба. Однако, поскольку нормальный белок восприимчив к протеиназам, на второй полосе изгибы не видны. На третьей дорожке показан протеаза, переваренный соскоб положительного контрольного образца.

Протеазы вызывают сдвиг в трех исходных полосах из-за потери n и c концов белков. Но инфицированные белки не могут быть полностью переварены, как это было в нормальном образце мозга. Протеиназная К, переваренная мозгом мыши, инокулированной фекалиями привитой вороны, показана справа и подтверждает наличие прионов в образце, поскольку полосы не перевариваются.

После просмотра этого видео у вас будет лучшее понимание того, как документировать прохождение инфекционного прионного материала через пищеварительную систему ворон. Затем проверьте заразность с помощью межбрюшинного биопроба мышей.