Обогащение и очистка эмбриональных стволовых клеток человека путем обнаружения поверхностных антигенов клеток с использованием моноклональных антител TG30 и GCTM-2

Общая цель этой процедуры состоит в том, чтобы отсортировать субпопуляции эмбриональных стволовых клеток человека по связыванию их антигенной поверхности с двумя моноклональными антителами TG 30 и GC TM. Это достигается путем предварительной диссоциации человеческих эмбриональных стволовых клеток или культур HESC в одиночные клеточные суспензии. На втором этапе HESC окрашивают моноклональными антителами, TG 30 и GCTM 2.

Наконец, клетки разделяют с помощью сортировки клеток, активированных флуоресценцией, и возвращают в культуру. В конечном счете, колониеобразующая способность отсортированных клеток может быть оценена с помощью проточной цитометрии и фазово-контрастной микроскопии. Основное преимущество этого метода по сравнению с существующими методами, такими как визуальное наблюдение, заключается в том, что он обеспечивает объективную меру плюрипотентности на клеточной основе для большого числа клеток, и это облегчает отделение эмбриональных стволовых клеток от дифференцированных клеток.

Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области плюрипотентности, например, как изменения в условиях культивирования количественно влияют на различные линии эмбриональных стволовых клеток человека и индуцированные плюрипотентные стволовые клетки человека. Сегодня эту процедуру продемонстрируют ученые из моей лаборатории, Джордж Зои Хун Чи и Бэй Ванг, чтобы получить суспензию одиночных клеток Гесса, начните с аспирации питательной среды Гесса из двух колб T 75, содержащих культивируемую клеточную линию Гесса. Вымойте каждую колбу 10 миллилитрами DPBS, а затем инкубируйте каждую культуру с тремя миллилитрами раствора диссоциации, экспрессированного тройным Е при 37 градусах Цельсия и 5% CO2.

Через пять минут ударьте по стенке колбы, чтобы выбить клетки, а затем подтвердите отслоение под микроскопом. Далее добавьте в каждую колбу по 10 миллилитров холодных питательных сред с помощью стерильной пипетки объемом 10 миллилитров. Осторожно тритируйте диссоциированные клетки несколько раз у стенки колбы, чтобы получить преимущественно одноклеточную суспензию.

Теперь объедините суспензии одиночных клеток hes через сетчатый фильтр для клеток 70 микрон в стерильную полипропиленовую пробирку объемом 50 миллилитров для окрашивания поверхностных антигенов клеток Гесса. Сначала Eloqua ввела около 100 000 клеток в 150 микролитровых средах в каждую из шести контрольных 1,5-миллилитровых микроцентрифужных пробирок. Затем инкубируют контрольные пробирки и оставшуюся сортировочную пробу с первичными антителами, представляющими интерес, в конечных реакционных объемах 200 микролитров и около девяти миллилитров соответственно в питательных средах, включая контрольные изотипы.

Поместите трубки горизонтально на лед и аккуратно перемешивайте их в течение 30 минут на качающейся платформе. После вращения клеток отбросьте надосадочную жидкость, а затем промойте образец сортировки в 20 миллилитрах холодной питательной среды, а контрольные образцы — в 200 микролитрах той же среды. Теперь инкубируют сортировочный образец в конечном объеме 2,5 миллилитра с соответствующими вторичными антителами в холодных питательных средах, а контрольную группу - в 200 микролитровом конечном объеме того же объема, добавляют свежеприготовленное PE анти-US антитело CD 90.2 в соответствующую контрольную пробирку в это же время.

Еще раз аккуратно перемешайте трубочки горизонтально на льду в течение 30 минут на качающейся платформе. После вращения клеток снова суспендируйте сортировочный образец в 20 миллилитрах холодной питательной среды, а контрольную часть в 200 микролитрах и дважды промойте клетки в этой среде. Ресуспендируйте сортовой образец в двух-трех миллилитрах холодных питательных сред с добавлением йодида пропидия и в каждом из контрольных элементов, за исключением неокрашенных клеток, в 300 мкл того же вещества.

Затем процедите каждую отдельную клеточную суспензию через сетчатый фильтр с крышкой 35 микрон, соединенный с пятимиллилитровыми полистирольными пробирками с круглым дном, и центрифугируйте пробирки, чтобы насильно вдавить в пробирки любые остатки клеточной суспензии на крышках сетчатых фильтров. Затем постукивайте по сторонам трубок, чтобы снова суспензировать каждую суспензию отдельных клеток, и поместите клетки на лед. Настройте проточный цитометр для сортировки двух флуоресцентных активированных клеток TG 30 GCTM таким образом, чтобы диссоциированные суспензии клеток Гесса стробировались как одиночные клетки для устранения потенциальных сгустков и дублетов.

Затем удалите потенциальный мусор с помощью передних и боковых рассеивающих затворов, чтобы были отсортированы только неповрежденные ячейки. Затем исключите нежизнеспособные клетки на основе их экспрессии йодида пропидия. Вытеснение эмбриональных фибробластов или фидерных клеток мыши путем отрицательного отбора, основанного на их экспрессии мышиного CD 90.2 pe.

Установите TG 30 G CTM два отрицательных шага в соответствии с фоновой автофлуоресценцией для неокрашенных клеток, а также контролем изотипа. Выделенная жизнеспособная фракция HESC, свободная от метамфетаминовых фидеров, может быть затем окончательно фракционирована на TG 30 отрицательный GCT M, два отрицательных TG 30 low GCT M, две низкие TG 30 mid GC TM две средние и TG 30 high GCTM две высокие субпопуляции. После настройки проточного цитометра добавьте по одному миллилитру кондиционированной среды метамфетамина в каждую из двух пятимиллилитровых полистирольных пробирок с круглым дном и положите их на лед.

Затем извлеките по 400 000 клеток из дифференцированной TG 30 отрицательной GC TM двух отрицательных и плюрипотентной TG 30 высокой GCTM двух высококлеточных субфракций. После вращения коллекторных трубок реаверсионная суспензия каждой клеточной гранулы в одном миллилитре предварительно уравновешенной среды, кондиционированной MEF. Затем засейте одну предварительно уравновешенную, одну треть колбу плотности MEF T 75 с HESC из каждой фракции в среде, кондиционированной метамфетамином, инкубируйте клеточные культуры при температуре 37 градусов Цельсия при 5% CO2, обновляя среду ежедневно в течение примерно двух недель.

Культуры плюрипотентных TG 30 с высоким GCTM двумя высокими клетками демонстрируют человеческие стволовые колонии через одну неделю и достигают около 80% беглости речи через 9-11 дней. Культуры TG 30 отрицательных GC TM двух отрицательных клеток в основном растут в виде газона из фибробластов, подобных клеткам, которые достигают беглости в течение 11-13 дней. Комбинированное обнаружение антигенов клеточной поверхности TG 30 и GC TM two позволяет различать ряд клеточных субпопуляций на плюрипотентной стадии и на различных стадиях ранней дифференцировки HESC, на что указывает их экспрессия маркеров стволовых клеток и специфичных для линии факторов транскрипции, в соответствии с предыдущими отчетами, TG 30 GC TM два отрицательных минимума, средние и высокие субфракции могут быть различимы в эмбриональных стволовых клетках человека мужского пола Одна линия, использованная для этого исследования здесь, процентное соотношение различных гейтированных субпопуляций, типичных для анализа двухпоточной цитометрии TG 30 GCTM, показано в эксперименте, показанном здесь.

Определенное количество TG 30 отрицательных GCT M двух отрицательных клеток последовательно культивировали после сортировки в течение примерно двух недель, а затем использовали для сбора только TG 30 отрицательной GCT M двух отрицательных фракций перед повторным покрытием. При каждом пассаже результаты показывают, что исходная TG 30 отрицательная gct M две отрицательные субфракции обогащает TG 30 отрицательные GCT M две отрицательные дифференцированные клетки после последовательной упаковки. Незначительная популяция TG 30 high GCT M two high cells обнаруживается при первоначальном пассаже, но в конечном итоге исчезает при дальнейшей упаковке, оставляя только плюрипотентные образцы стволовых клеток, свободные от стволовых клеток.

Здесь показана типичная морфология газона из дифференцированных TG 30 отрицательных GCT M двух отрицательных клеток через 14 дней. Обратите внимание, что спорадические колонии, подобные HESC, наблюдаемые через 14 дней, смешиваются с TG 30 отрицательным GC TM двумя отрицательными клетками, которые, скорее всего, генерируются загрязняющими TG 30 high GCT M, двумя высокими клетками. Обратите внимание, что это происходит редко, и в первоначальном постфактологическом обзоре, основанном на предыдущих наблюдениях с использованием этого анализа, ожидается, что сбор и культивирование двух высоких клеток TG 30 с высоким уровнем GCTM должны обогатить колониеобразующие плюрипотентные ГСК.

Таким образом, в этих представительных культурах также исследовали последовательную упаковку плюрипотентных TG 30 high GCTM two high cells после сортировки методом проточной цитометрии, клетки сортировали факсом с использованием TG 30 и G CT M two, заменяя только TG 30 high G CTM двумя высокими клетками на каждом пассаже. Таким образом, было замечено, что большинство клеток были расположены в субфракциях, связанных с плюрипотентностью, что указывает на обогащенную популяцию плюрипотентных клеток, которая также сохраняет способность к дифференцировке и регенерации небольшого процента TG 30 негативных G CTM двух отрицательных клеток. Кроме того, последовательные культуры TG 30 high G CTM двух высокосортированных клеток демонстрируют большое количество HESC-подобных колоний после пассирования, что также указывает на поддержание плюрипотентного состояния.

При выполнении этой процедуры важно помнить о калибровке факсимильного аппарата перед каждым разом, чтобы обеспечить воспроизводимость результатов после этой процедуры. Другие методы, такие как микрочипы, секвенирование всего генома или тератомы, могут быть выполнены, чтобы ответить на такие вопросы, как действительно ли эти клетки плюрипотентны после их развития? Этот метод проложил путь исследователям в области индуцированных плюрипотентных стволовых клеток к изучению безопасности и стабильности этих клеток по сравнению с человеческими эмбриональными стволовыми клетками.

После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее понимание того, как тщательно готовить и окрашивать смешанные культуры человеческих enbr стволовых клеток с целью обогащения на периетные клетки. Не забывайте, что работа с человеческими клетками может быть чрезвычайно опасной, и при выполнении этой процедуры всегда следует соблюдать меры предосторожности, такие как ношение перчаток и работа со вторым классом у защитного шкафа.