Использование сокультивирования обнаружить химически опосредованной межвидовых взаимодействий

Общая цель данного эксперимента заключается в выявлении взаимодействий между различными микробами, которые опосредуются секретируемыми соединениями и приводят к изменениям в экспрессии бактериальных генов. Это достигается путем культивирования штамма бактерий, содержащего флуоресцентный транскрипционный репортер, с микробами окружающей среды в виде колоний на агаровых пластинах Петри. Оранжевые круги обозначают колонии микробов окружающей среды.

В то время как синие круги являются колониями репортера, рост на твердой среде позволяет метаболитам, которые эти колонии производят, диффундировать через агар и активировать экспрессию генов в близлежащих колониях-репортерах. Потенциальные попадания звезд — это те колонии, которые могут секретировать соединения, изменяющие экспрессию генов в репортере. Эти организмы выделяют из экранных планшетов для совместной культуры.

Эти потенциальные индукторы повторно тестируются на вторичном скрининге, чтобы подтвердить, что они были микроорганизмами, секретирующими молекулы, которые изменяют экспрессию бактериальных генов в репортере. Хотя этот метод дает представление о биопленкообразующих взаимодействиях бацилл тонких с почвенными организмами, он также может быть применен к другим системам, таким как микробные взаимодействия, которые влияют на экспрессию вирулентности у видов стафилококка или pseudomona. Действительно, теоретически он может быть применен для выявления микробных взаимодействий, которые изменяют экспрессию генов для любого репортера в любом генетически поддающемся лечению микробе После создания флуоресцентных репортерных конструкций для вашего организма по вашему выбору, в соответствии с текстовым протоколом, соберите почву, удалив верхние 0,5 сантиметра открытой поверхности почвы, прежде чем использовать шпатель для сбора почвы и конических трубок. Добавьте 0,85% стерильного физиологического раствора в соотношении 10 миллилитров на один грамм почвы, чтобы получилась почвенная суспензия, и похлопайте ее в течение одной минуты, чтобы выбить бактерии из частиц почвы.

Дав почвенному раствору отстояться в течение одной минуты, перенесите верхний водный слой в свежую пробирку, разбавьте репортер и образцы почвы в соответствии с текстовым протоколом и нанесите по 50 микролитров каждого из них на центр экранных пластин для сокультур в условиях, которые не активируют репортер в одиночку. Кроме того, в качестве контрольных элементов поместите в таблицу только образец почвы и только репортер. Добавьте около 23 миллиметровых стерильных стеклянных шариков на каждую пластину и распределите ячейки, держа пластины на столе и встряхивая их вперед и назад.

Вращая до тех пор, пока жидкость не впитается, переверните пластины и выбросьте шарики в стакан для отходов, содержащий этанол. После инкубации планшетов для совместного культивирования с использованием флуоресценции и начиная с верхней части планшета, медленно перемещайте планшет вперед и назад по полю зрения к ярким пятнам. После одного полного взмаха поверните тарелку на 90 градусов и повторите процесс.

При обнаружении флуоресцентного пятна медленно включайте освещение в ярком поле и определяйте, связана ли флуоресценция с колонией бактерий. Выделить предполагаемые индуцирующие организмы, которые будут представлять собой нефлуоресцентные колонии, расположенные ближе к флуоресцентным колониям. Расположите их в центре поля зрения и сделайте их доступными для доминирующей руки, оставив люминесцентную лампу включенной.

Медленно включите Brightfield, чтобы определить по форме и положению флуоресцентную колонию и окружающие индуцирующие организмы Используя стеклянный стержень, возьмите стерильный круглый гелевый наконечник объемом 200 микролитров и держите его, как карандаш. Положите внешнюю ладонь на стол, чтобы стабилизировать ее на рабочей поверхности. Затем положите другую руку на внутреннюю сторону большого пальца руки, чтобы стабилизировать инструмент для комплектации, удерживая наконечник пипетки над поверхностью пластины.

Переместите его в поле зрения и центрируйте над колонией, которую вы хотите выбрать. Наконечник будет не в фокусе. Используя внешнее ребро ладони, медленно поверните кончик пипетки вниз к колонии, которую нужно собрать.

Прикоснитесь к нему очень легко, стараясь свести к минимуму количество других колоний, с которыми соприкасается наконечник, не вращая инструмент для комплектации. Нанесите кончик на часть свежей тарелки. После сбора колоний инкубируйте планшеты в соответствии с рекомендациями по анализу.

Когда колонии видны, используйте стереоскоп, чтобы определить, растут ли на пластине один или несколько типов организмов, переложите каждый морфотип на свежую пластину и инкубируйте до тех пор, пока они не вырастут. Чтобы проверить, являются ли предполагаемые индукторы истинными индукторами, подготовьте газоны для репортеров и нефлуоресцентных родительских сортов. После того как пластины высохнут, используйте стерильные зубочистки, чтобы выбрать клетки из тестовых колоний.

Нанесите заплатку на чистую пластину, а затем на две тарелки для газона. В качестве альтернативы можно провести респензию, суспензировать предполагаемые индуцирующие микроорганизмы в одном миллилитре жидкой среды в стерильном пластиковом ветеринарном учреждении и измерить наружный диаметр 600 суспензий после нормализации внешнего диаметра каждой суспензии, чтобы получить наружный диаметр 600 0,5 точки, по одному микролитру каждой суспензии на каждый из трех планшетов. Наконец, после того, как организмы начнут расти, используйте флуоресценцию под препарирующим микроскопом для идентификации предполагаемых индуцирующих организмов, которые активируют флуоресцентный репортерный штамм, но не штамм родительского контроля.

Этот скрининг был использован для идентификации почвенных организмов, секретирующих соединения, которые изменяют экспрессию генов структурного компонента матрицы биопленки в b-тонкостях с использованием флуоресцентного транскрипционного репортера. В идеале, каждая пластина для совместной культуры должна содержать соотношение репортера к почвенным колониям, которые являются близко расположенными отдельными колониями. Здесь мы проиллюстрируем, как наличие высокого соотношения репортерных колоний, показанных синими кругами, по отношению к почвенным колониям, показанным коричневыми кругами, повышает уверенность в определении фактического индуцирующего организма из пластин совместного культивирования.

Индуцирующие почвенные организмы выделяют соединения, которые активируют репортер. На пластине будут индуцированы множественные репортерные колонии с более высоким отношением репортеров к почве, что облегчает идентификацию истинных индукторов, показанных красным цветом, от других предполагаемых индукторов, обозначенных звездами. Содержание питательных веществ контролирует степень образования колоний, в то время как разбавление инокулюма определяет, правильно ли рассредоточены образовавшиеся колонии.

Как видно на примере этой совместной культуры, изображение B Tintles создает флуоресцентную биопленочную матрицу в ответ на многочисленные микробы из почвы. Для почв, которые мы исследовали, у нас был высокий процент попаданий в матричный репортер Ptap A YFP. Это контрастирует с нашими неопубликованными результатами с аналогичных экранов.

Используя споруляцию и компетентность репортеров, было выявлено мало или вообще не было выявлено ни одного попадания. Таким образом, показатели HI для различных типов клеток сильно варьируются, и их может быть трудно предсказать заранее. Здесь показаны два примера скрининговых пластин для совместной культуры до и после того, как потенциальные индуцирующие колонии были отобраны для изоляции.

Здесь показаны отрицательные и положительные результаты как патч-, так и точечного метода, при этом примерно 50% колоний, исследованных на нашем вторичном скрининге, являются истинно положительными. После этой процедуры могут быть выполнены другие методы для ответа на дополнительные вопросы, например, секвенирование ДНК 16 с SR для определения филогенетической идентичности индуцирующего организма или использование масс-спектрометрии ВЭЖХ в ЯМР для определения химической идентичности активного соединения.