Рано Метаморфические вставки Технология насекомых полета контроля действий

Здравствуйте, я Алекс Дербер из лаборатории доктора Альберта Боса с кафедры электротехники Университета штата Северная Каролина. Сегодня мы продемонстрируем новый хирургический метод имплантации электродов в manica sex на ранних стадиях метаморфоза.

В данной процедуре, называемой технологией ранней метаморфотической имплантации (Early Metamorphic insertion technology), имплантированные электроды интегрируются в ткани насекомого на стадии куколки. Основным преимуществом данной процедуры является обеспечение механически стабильного и электрически надежного соединения с нервно-мышечной тканью, что позволяет изучать нейрофизиологию полета насекомого. Во взрослой фазе IC Mensa проходит через метаморфотический жизненный цикл, который длится около 40 дней.

Жизненный цикл Mensa начинается со стадии яйца. Через семь—10 дней личинка вылупляется и достигает третьей звездной стадии личинки. Всего существует пять звездных стадий личинки, и на каждой из них личинка проходит через процессы сбора энергии и роста.

Через пять-шесть дней после пятого личиночного возраста насекомое переходит в раннюю стадию куколки. В период окукливания происходит масштабная дегенерация и последующая регенерация тканей насекомого. Подготовка к выходу взрослой моли занимает от 17 до 19 дней.

На ранней стадии куколки, перед переходом в позднюю стадию и во время самой поздней стадии куколки, мы хирургическим путем имплантируем электропроводящий электрод в дорсальную часть грудного отдела куколки. Ткани разрастаются вокруг имплантированных электродов, обеспечивая их надежную фиксацию в теле насекомого. В течение нескольких дней электроды, введенные в грудной отдел куколки, становятся частью тела насекомого на финальной взрослой стадии в виде мотылька, что позволяет использовать процесс перестройки всей тканевой системы насекомого.

В процессе метаморфоза электроды имплантируют в косвенные летательные мышцы груди. К группам мышц, которые косвенно отвечают за движение крыльев, относятся дорсо-вентральные и дорсо-лонгитудинальные мышцы. В данном видео мы продемонстрируем введение электрода в дорсо-вентральные мышцы, которые косвенно отвечают за подъем крыла.

С помощью данной имплантации мы будем осуществлять беспроводную запись электромиограммы дорсо-вентральных мышц во время движения личинки. Насекомое удерживается на платформе с электромагнитной левитацией внутри светодиодной арены, которая стимулирует движение. Процедура имплантации по технологии раннего метаморфоза начинается с изготовления печатной платы, которая будет использоваться в качестве интерфейса между имплантированными электродами и регистрирующим оборудованием.

Проволочные электроды припаяны к печатной плате, которая подключается через плоский гибкий кабельный разъем. Для начала измерьте и вырежьте из фольгированного стеклотекстолита фрагмент размером 0,5 на 5 см², используя перманентный маркер с тонким наконечником и ножницы. Тем же маркером с тонким наконечником нарисуйте три контактные площадки размером 0,1 на 5 см² в качестве маски для травления.

Используйте инструмент с прямой кромкой, например линейку, чтобы нанести разметку вдоль всей длины вырезанного медного ламината. Убедитесь, что метки четкие и не пересекаются друг с другом. Если линии разметки пересекутся, произойдет короткое замыкание электродов.

При подключении к разъему плоского гибкого кабеля, чтобы не привести платы в негодность, перенесите вырезанную медную заготовку в вентилируемое помещение, предпочтительно под вытяжной шкаф, для травления маркировки на медном ламинате. Соблюдайте осторожность при травлении печатных плат, так как используемые вещества токсичны. При проглатывании или попадании внутрь они могут вызвать отравление, а при контакте с кожей — раздражение. Наклейте тефлоновую ленту на один край медной заготовки, закрыв примерно один сантиметр по длине.

Затем прикрепите вырезанную медную ламинированную заготовку к внутренней стенке мерного стакана с помощью скотча так, чтобы половина медной полосы была погружена в травильный раствор. Поместите стакан на вращающуюся платформу на 20 минут. Извлеките протравленную медную ламинированную заготовку из стакана и поместите ее в стакан с водой на 10 минут.

Для промывки остатков нанесите изопропиловый спирт на безворсовую салфетку и протрите маркировку, чтобы обнажить нетравированные медные контактные площадки. Удалите все следы перманентного маркера. Разрежьте печатную плату на небольшие квадраты длиной примерно один сантиметр.

После травления печатных плат необходимо подготовить электроды к закреплению. Рекомендуется выполнять эти действия под микроскопом. С помощью острого лезвия отрежьте два отрезка длиной по 3 см из изолированного никелированного провода из нержавеющей стали с диаметром по изоляции 0,11 дюйма и диаметром жилы 0,008 дюйма.

Эти отрезки проволоки из нержавеющей стали представляют собой активные электроды, которые будут вводиться в грудной отдел насекомого. С помощью лезвия бритвы удалите четыре-пять миллиметров пластиковой изоляции с каждого конца каждой проволоки. Затем обрежьте.

Один отрезок изолированного провода из нержавеющей стали длиной 0,7 сантиметра для создания удлинителя наконечника заземляющего электрода. Осторожно удалите изоляцию с помощью лезвия бритвы, как это было сделано на предыдущем этапе, или расплавьте ее жалом паяльника. Затем отрежьте один кусок литицевого провода длиной 4,5 сантиметра.

Для этой пайки также можно использовать провод индуктора. Ранее подготовленный отрезок наконечника из нержавеющей стали длиной 0.7 сантиметра припаивают к проводу заземления Lititz. На конце заземляющего провода должен оставаться открытый наконечник из нержавеющей стали.

Прикрепите вытравленную печатную плату к рабочей поверхности для пайки с помощью тефлоновой ленты. Расположите ленту на плате так, чтобы один-два миллиметра контактных площадок оставались открытыми для пайки электродов к плате. Свободные от припоя концы площадок, закрытые маской, будут вставлены в разъем FCC.

Закрепите три провода электродов с помощью тефлоновой ленты так, чтобы один конец каждого провода можно было припаять к соответствующим контактным площадкам на плате электродов. Два активных электрода следует припаять к площадкам у краев платы. Заземляющие электроды следует припаять к центральной площадке.

Нанесите флюс для нержавеющей стали на контактные площадки электродов для облегчения пайки. Будьте осторожны, чтобы не допустить короткого замыкания между контактами из-за избытка припоя. Погрузите электроды сначала в ацетон, а затем в изопропиловый спирт на 10 минут в каждой среде.

Для удаления остатков припоя. Растворы можно налить в отдельные кюветы или стаканы. Для повышения эффективности очистки электроды вместе с чистящими растворами можно поместить в ультразвуковую ванну во время погружения. Насекомые будут наиболее активны в периоды перехода от дня к ночи.

Следовательно, в камере для насекомых с помощью автоматических таймеров розеток необходимо установить искусственный цикл смены дня и ночи. Таймеры следует настроить так, чтобы имитировать цикл из семи часов темноты и 17 часов света. Ежедневно осматривайте manduka sex eye pu eye, чтобы определить подходящее время для введения.

Глаза куколки готовы к имплантации примерно через один день после крыльев. Имплантация в области темных пятен наиболее успешна, если она проводится за семь-четыре дня до закрытия окуляров. Более темная куколка снизу готова к хирургической имплантации электродов; перед этим куколку необходимо анестезировать.

Поместите их в холодильник при температуре 4 °C примерно на шесть часов. Затем подготовьте рабочее пространство для введения. В рабочем пространстве должны находиться изопропиловый спирт, острые пинцеты и игла для подкожных инъекций 30 G.

В качестве альтернативы для более надежной фиксации электродов можно использовать цианоакрилатный клей; простерилизуйте пинцет для игл и электроды, погрузив их в изопропиловый спирт или протерев им. Через шесть часов извлеките зрачок из холодильника и перенесите его в рабочую зону. Определите область на дорсальной стороне грудного отдела, соответствующую интересующей группе мышц.

В данном случае нас интересуют дорсо-вентральные мышцы, отвечающие за движение крыла вверх. Используя острое лезвие или гиподермическую иглу, осторожно процарапайте квадрат со стороной 1 на 1 см через слой экзокутикулы. С помощью пинцета медленно удалите эти фрагменты.

С помощью пинцета удалите волоски с открытого участка груди. Для облегчения процесса очистки можно дополнительно использовать вакуумный аспиратор. Важно удалить как можно больше волосков, чтобы они не препятствовали установке электродов.

Медленно введите иглу примерно на пять миллиметров в мезоторакс, в область прикрепления крыльев к груди, чтобы создать две точки введения, нацеленные на группу мышц. Запомните расположение отверстий, так как в случае потери их может быть трудно найти. Зафиксируйте куколку на столе и с помощью пинцета направьте два регистрирующих электрода в две точки введения; этот вариант позволяет повысить механическую устойчивость.

Очистите от волосков область вокруг электродов и с помощью аппликатора для проводов обильно нанесите клей цианоакрилат вокруг каждого места введения в грудной отдел. Подготовьте клетку для ELO, застелив стенки и потолок грубым текстурированным материалом, по которому насекомое сможет перемещаться. После выхода имаго можно использовать перфорированные картонные коробки или упаковочную бумагу.

Подготовьте жесткую фиксацию. Используйте стержень длиной около six centimeters и диаметром two millimeters. Осторожно просуньте этот стержень через отверстие под выступающими проксами.

Пластиковые мешалки. Для этого этапа можно использовать ватную палочку или металлические проволоки. Закрепите оба конца палочки на поверхности клетки так, чтобы куколка не могла перекатываться.

Поместите куколку в клетку так, чтобы среднегрудь была обращена вверх. Интенсивные движения могут привести к повреждению электродов, потере геля или сделать введение бесполезным. Заземляющий электрод следует ввести в брюшко или дистальные отделы груди.

Чтобы избежать перекрестных помех (связи сигналов), установку дисина можно проводить либо на поздних стадиях развития куколки, либо после выхода насекомого из куколки. Место установки заземляющего электрода должно быть подготовлено на стадии куколки как для установки на этой же стадии, так и для установки на стадии взрослого насекомого. В данном случае демонстрируется установка заземляющего электрода на стадии взрослого насекомого.

Поместите мотыльков в холодильник при температуре 4 °C на шесть часов. Для иммобилизации путем холодного воздействия подготовьте рабочее место для введения, включая изопропиловый спирт, острый пинцет, подкожную иглу 30-го калибра, клей Creole, кусочек проволоки для нанесения клея, а также (опционально) термический коагулятор и стоматологический воск в стике. Как и прежде, окуните иглу в изопропиловый спирт перед контактом с мотыльком. В точке введения, расположенной примерно в 1–2 см от регистрирующих электродов вдоль задней части брюшка, медленно введите иглу, чтобы проколоть брюшко и создать отверстие для введения.

Игла не должна проникать глубже четырех миллиметров. Если в месте введения появляется гемолимфа, значит, игла введена слишком глубоко, что снижает вероятность успеха процедуры. С помощью пинцета аккуратно вставьте заземляющий электрод в место введения и прижмите его так, чтобы глубина погружения составляла от трех до четырех миллиметров.

Удерживайте электрод на месте и, в качестве дополнительного шага, нанесите клей вокруг места введения с помощью тонкой проволоки. Для дальнейшего повышения механической прочности фиксации используйте термический коагулятор, сформировав на его кончике небольшую каплю воска размером два-три миллиметра. Поднесите кончик коагулятора близко к месту введения и приложите тепло так, чтобы расплавленный воск окружил электрод и надежно зафиксировал его на месте.

После охлаждения дайте насекомому один день для восстановления после имплантации перед проведением экспериментов. Для подключения электродной платы на насекомом к головному блоку (head stage) компании Triangle Biosystems International требуется адаптерная плата с разъемами для плоского гибкого кабеля. В качестве адаптерной платы используется плата из травленого медного ламината, которую необходимо подготовить, следуя шагам, описанным ранее для подготовки электродной платы; на паяльной станции припаяйте разъем плоского гибкого кабеля к одному концу подготовленной платы.

10-контактный разъем для плоского гибкого кабеля можно припаять к плате так, чтобы две пары контактов по краям разъема и центральная пара контактов соприкасались с тремя медными контактными площадками. Затем припаяйте три соединительных провода калибра 30 AWG к трем площадкам. На другом конце платы припаяйте три мини-разъема к трем площадкам на плате-адаптере для снятия показаний осциллографа, как описано выше.

На следующем этапе расположите два разъема перпендикулярно краям платы. Центральный разъем должен быть немного наклонен вверх, в сторону от плоскости платы; припаяйте другой конец этих трех проводов к разъему головного блока, предоставленному компанией Triangle Biosystems International.

Затем печатную плату головного модуля следует закрепить сверху на левитационной раме для обеспечения надежности электродов и контроля соотношения сигнал/шум. Можно получить записи с помощью осциллографа, подключенного кабелем. Перед развертыванием системы беспроводной регистрации подключите осциллограф к многоканальному усилителю для регистрации AC-нейронных сигналов.

Установите следующие параметры усилителя: частоту среза фильтра верхних частот 1 Hz, частоту среза фильтра нижних частот 20 kHz и коэффициент усиления 100. Подключите каждый из гнезд миниатюрных разъемных соединений на адаптерной плате к входным каналам усилителя. Извлеките из клетки насекомое с имплантированной платой электродов.

Когда насекомое находится в активном состоянии, с помощью пинцета под него можно поместить фрагмент ткани, чтобы оно могло на нем зафиксироваться перед началом измерений; затем вставьте плату электродов в разъем плоского гибкого кабеля на адаптерной плате. Удалите ткань из-под насекомого и наблюдайте за возникновением спайков электромиограммы. В то время как насекомое взмахивает крыльями, зарегистрируйте и сохраните данные на осциллографе.

На этом рисунке показан сигнал мышечного потенциала, зарегистрированный с помощью осциллографа от одной из мышц до и во время взмахов крыльями. Сигнал был обработан с усилением в сто раз, с использованием фильтра верхних частот 1 Hz, фильтра нижних частот 20 kHz и в период покоя. Мышечные потенциалы не наблюдаются.

Мышечные потенциалы при взмахах крыльев возникают с частотой примерно 15–20 hertz. После сбора и проверки данных осциллографа следует приступить к регистрации беспроводных сигналов ЭМГ. Для беспроводной записи сигналов ЭМГ во время удерживаемого полета Manus sex может быть сконструирована платформа с электромагнитной левитацией.

Левитационная платформа состоит из рамы, предназначенной для балансировки удерживающего механизма. Свободное парение позволяет раме и, следовательно, насекомому ya. При тестировании без ограничений, создаваемых удерживающими нитями, рама может быть изготовлена методом быстрого прототипирования с использованием установки моделирования методом послойного наплавления.

Эта рамка с закрепленным магнитом левитирует за счет серии электромагнитов, расположенных в базовой платформе. Левитирующая платформа находится внутри светодиодной арены, которая была сконструирована из 60 панелей, каждая из которых представляет собой массив из пяти на семь отдельных светодиодов. Управление ареной осуществляется с помощью микроконтроллера APIC 18 F 45 20, что позволяет имитировать вращение как по часовой стрелке, так и против нее, а также регулировать скорость вращения.

Настройте систему беспроводной регистрации TBSI. Для этого подключите головной блок TBSI к разъему платы адаптера на левитационной платформе. Извлеките насекомое из клетки, когда оно активно, предпочтительно в предрассветное время.

Используя пинцет, аккуратно вставьте плату с электродами в разъем плоского гибкого кабеля на левитирующей раме так, чтобы насекомое было надежно зафиксировано в установке. Поднесите магнитный стержень к магнитному переключателю на головном блоке, чтобы активировать беспроводную передачу данных.

Загорится синий индикатор, сигнализирующий о том, что головной блок активен и готов к записи. Выключите свет в помещении для обеспечения полной темноты и запустите программное обеспечение TBSI neuro aware на компьютере. Для дополнительного освещения комнаты можно использовать красную лампу.

Выберите соответствующий конфигурационный файл. В данной процедуре используется конфигурационный файл с настройками по умолчанию W five. Затем нажмите кнопку start deck в верхнем левом углу исходного интерфейса.

Чтобы начать просмотр сигналов в системе регистрации TBSI, выберите вкладку окна «all channels» для наблюдения за сигналами ЭМГ. Для обеспечения надежного беспроводного соединения и работы электродов включите все светодиодные компоненты арены, регулируемый источник питания постоянного тока и микроконтроллер. Плавно сбалансируйте левитационную платформу внутри арены.

Выберите вкладку «Record to binary» на левой панели интерфейса NorAware. Укажите время записи и путь для сохранения файла. Выберите соответствующие настройки вывода для сохранения ваших данных.

Нажмите кнопку запуска, чтобы начать сеанс записи в программном обеспечении для записи TBSI. Файл будет сохранен в формате .next, который можно импортировать в широко используемые программы для обработки данных.

Наблюдайте за тем, как насекомое летит в направлении, соответствующем движению светодиодов. Измените направление движения светодиодов на противоположное и убедитесь, что насекомое также меняет направление полета. Повторите эту процедуру необходимое количество раз. Стрелка указывает направление вращения светодиодного паттерна.

Стрелка становится желтой. Когда насекомое совершает поворот против часовой стрелки, стрелка становится синей, когда насекомое совершает поворот по часовой стрелке. Речь в воспроизведении фильма ускорена на 50% по сравнению с обычной скоростью.

На этом рисунке показан сигнал мышечного потенциала, зарегистрированный с помощью беспроводного оборудования для одной мышцы до и во время взмахов крыльями в период покоя. Мышечные потенциалы не наблюдаются. Мышечные потенциалы во время взмахов крыльями возникают с частотой примерно 15–20 hertz.

Здесь мы продемонстрировали запись с одного канала. Однако многоканальная запись, полученная с помощью данной установки, может быть использована для наблюдения за координацией нескольких групп мышц во время полетных маневров. Мы только что показали вам, как выполнить введение электродов на ранней стадии метаморфоза в переходный период от личинки к куколке.

Важно подобрать время введения электрода на поздней стадии куколки так, чтобы оно не было слишком ранним или поздним. В противном случае могут возникнуть трудности с созданием надежной конфигурации электродов. Мы также продемонстрировали, как собрать электрические компоненты, необходимые для беспроводной записи данных ЭМГ из непрямых летательных мышц, пока насекомое находится в состоянии левитации в светодиодной арене.

Благодарим за просмотр и желаем успехов в ваших экспериментах.