Drosophila: развитие и размножение

Drosophila melanogaster широко используются в качестве модельного организма при изучении развития и репродукции. Drosophila проходят через несколько стадий развития в процессе, известном как жизненный цикл, и каждая стадия представляет собой уникальную платформу для исследований в области развития. В этом видео мы представим основы развития и репродукции Drosophila, включая способ организации генетического скрещивания, и обсудим, как эти исследования могут быть применены для понимания процессов, начиная от заживления ран и заканчивая поведением.

Для начала разберем жизненный цикл Drosophila. Развитие Drosophila проходит через 4 основные стадии: эмбрион, личинка, куколка и имаго (взрослая особь).

Эмбрион представляет собой оплодотворенное яйцо овальной формы длиной около 0.5 mm. Сразу после оплодотворения эмбрион подвергается быстрому митотическому делению без роста. Зиготическое ядро проходит девять раундов ядерного деления без цитокинеза, в результате чего образуется многоядерная клетка, называемая синцитиальным бластодермом. Поскольку все ядра в синцитиальном бластодерме находятся в общей цитоплазме, белки могут свободно диффундировать, формируя градиенты морфогенов, которые имеют важное значение для определения плана строения тела и паттернирования отдельных органов и тканей мухи. После 10-го ядерного деления ядра мигрируют к периферии синцитиального бластодерма. После 13-го раунда ядерного деления, которое происходит примерно через 3 часа после оплодотворения, 6000 ядер в синцитиальном бластодерме обособляются, образуя клеточный бластодерм. Клеточный бластодерм состоит из монослоя клеток, который в процессе, называемом гаструляцией, превращается в сложную многослойную структуру. Во время гаструляции изменения формы клеток приводят к инвагинации монослоя, что в итоге приводит к созданию зародышевых листков: энтодермы, мезодермы и эктодермы. Из энтодермы развивается кишечник, из мезодермы — мышцы и сердце, а из эктодермы — эпидермис и центральная нервная система. Через 24 часа из эмбрионов вылупляются личинки.

Личинки белого цвета с червеобразным сегментированным телом. Они постоянно питаются в увлажненном корме, что приводит к их быстрому росту. Личинки проходят три стадии развития: первая стадия (первый инстар) длится 24 часа, вторая стадия — еще 24 часа и третья стадия — 48 часов. Между каждой стадией происходит линька. Когда личинки третьего инстара готовы к окукливанию, они покидают источник пищи и прикрепляются к твердой поверхности, например, к стенке флакона.

Куколки неподвижны; изначально они мягкие и белые, но со временем твердеют и становятся коричневыми. В течение четырех дней личиночные ткани подвергаются дегенерации, и формируются ткани взрослой особи. Завершением стадии куколки является эклозия (вылет), в результате которой появляются взрослые мухи.

Через 8 часов после эклозии взрослые особи становятся половозрелыми и начинают спариваться, запуская жизненный цикл заново.

Полный жизненный цикл при 25 °C занимает около 10 дней, однако на него может влиять температура. Например, при 18 °C жизненный цикл длится около 19 дней, а при 29 °C — всего 7 дней.

В процессе развития тщательная генетическая регуляция формирования паттерна определяет план строения тела и специфицирует отдельные ткани и органы. Важно, что установление передне-задней оси определяет ориентацию организма от головы к хвосту и регулируется несколькими группами генов.

Во-первых, гены материнского эффекта содержатся в ооците и наследуются от самки. Они играют важную роль в синцитиальном бластодерме для первоначального определения переднего и заднего полюсов эмбриона. В частности, ген bicoid определяет переднюю часть эмбриона, включая голову и грудь, в то время как ген nanos определяет заднюю часть, включая брюшко.

Во-вторых, гены сегментации, которые регулируются генами материнского эффекта, включают гены gap-белков (гены брешей) и гены парных полос. Гены gap-белков формируют сегментированный план строения тела вдоль передне-задней оси путем грубого разделения эмбриона на области. Гены парных полос экспрессируются в виде полос, перпендикулярных передне-задней оси, что далее разделяет эмбрион на более мелкие сегменты. Затем гены сегментарной полярности, такие как engrailed, начинают определять судьбу клеток внутри каждого сегмента.

Наконец, гомеотические гены отвечают за определение конкретных анатомических структур, таких как крылья и ноги. Интересно, что порядок расположения генов на хромосоме отражает то, как они экспрессируются вдоль передне-задней оси.

Drosophila — чрезвычайно плодовитые организмы, которые за свою жизнь могут произвести тысячи потомков. Самки откладывают сотни яиц в день и продолжают оплодотворять их в течение длительного времени после спаривания.

Drosophila также являются половым диморфными организмами, что означает, что самки фенотипически отличаются от самцов. В частности, самцы меньше самок и имеют наружные половые органы темного цвета, а также больше черного пигмента на нижней части брюшка. Также у самцов на передних ногах имеется пучок щетинок, называемый секс-гребнем, который используется для закрепления на самке во время копуляции. Эти отчетливые фенотипические различия позволяют очень легко отличить самцов от самок, что особенно полезно при постановке генетического скрещивания.

Проведение скрещивания Drosophila является полезным методом изучения генетики. Приступим к работе!

Первым шагом при организации скрещивания является отбор девственных самок требуемого генотипа, чтобы можно было точно контролировать, с каким самцом будет происходить спаривание. Drosophila не способны к спариванию в течение первых 8 часов после выхода из куколки (эклозии), поэтому сбор очень молодых имаго гарантирует их девственность. Чтобы собрать только что вылупившихся самок, переместите содержимое пробирки в «морг» для удаления всех взрослых особей. Каждые 3-4 часа проверяйте пробирку на наличие новых имаго и собирайте самок в новую пробирку без самцов до начала использования. Девственных самок можно определить по очень светлому цвету тела и темному пятну на брюшке, называемому мекониумом.

Когда вы будете готовы начать скрещивание, поместите 4-6 самцов и 4-6 девственных самок нужных генотипов в пробирку с кормом, пометив ее датой, и храните при температуре 25° C и влажности 60%. Через 3-4 дня появятся личинки, и родителей следует перенести в новую пробирку, чтобы предотвратить их спаривание с потомством. Примерно через 10 дней вылупится новое поколение, и можно будет изучить их фенотипы.

Одним из инструментов, используемых исследователями Drosophila, являются балансерные хромосомы, которые предотвращают генетическую рекомбинацию и содержат генетические маркеры, такие как «загнутые крылья» (curly wings), что полезно для определения правильного генотипа мухи. Если вам нужны мухи, гетерозиготные по двум различным мутациям, вы можете скрестить линию с мутацией №1 на балансерной хромосоме CyO с другой линией, где мутация №2 также сбалансирована по CyO. Любое потомство, появившееся без загнутых крыльев, будет гетерозиготным по обеим мутациям.

Еще одним часто используемым инструментом в исследованиях Drosophila является система UAS-GAL4, которая позволяет исследователям экспрессировать или подавлять ген в конкретной ткани. GAL4 — это транскрипционный фактор дрожжей, который управляется тканеспецифичным промотором, а UAS — это Upstream Activating sequence (вышестоящая активирующая последовательность), которая контролирует экспрессию интересующего гена. Когда вы скрещиваете муху с тканеспецифичным трансгеном GAL4 с мухой, имеющей UAS-трансген с искомым геном непосредственно за ним, белок GAL4 связывается с UAS и запускает экспрессию вашего целевого гена. Например, при скрещивании UAS-GFP с apterous-GAL4, который специфичен для крыловых дисков куколки, GFP экспрессируется специфически в этих клетках.

Существует множество подходов, которые могут быть использованы для изучения развития и размножения Drosophila. Одним из таких подходов является поведенческий анализ, в частности, анализ поведения при ухаживании. Во время ухаживания самец ориентируется на самку и следует за ней, постукивая по ней передними ногами. Если самка восприимчива, она позволяет самцу совершить садку. Самец изгибает брюшко и переносит семенную жидкость в самку; этот процесс называется копуляцией. Анализ такого поведения при ухаживании у различных мутантов позволяет понять механизмы генетического контроля поведения

Развитие Drosophila представляет собой чрезвычайно динамичный процесс, включающий множество перемещений клеток и изменений их формы, которые можно изучать с помощью прижизненной визуализации. Например, дорсальное закрытие в ходе эмбриогенеза представляет собой закрытие зазора в эпителии по принципу «застежки-молнии», что требует координации многих типов клеток. Дорсальное закрытие в процессе развития часто используется в качестве модели для изучения заживления ран, что может иметь клиническое значение.

Третьим методом, используемым для понимания процессов развития Drosophila, является РНК-интерференция, которая подавляет активность отдельных генов и может применяться в крупномасштабных screens обратной генетики. Например, в эмбрионы можно ввести дсРНК, чтобы оценить влияние нокдауна гена на развитие органов. В данном случае РНК-интерференция позволила выявить ген, имеющий важное значение для слияния в процессе развития трахеальной системы.

Вы только что посмотрели вводное видео JoVE о репродукции и развитии Drosophila melanogaster. В этом видео мы рассмотрели жизненный цикл Drosophila, включая подробную информацию о каждой стадии развития. Мы также узнали, как использовать репродуктивные способности Drosophila для изучения генетики и постановки скрещивания. Наконец, мы разобрали, как развитие и репродукция Drosophila помогают в понимании таких сложных процессов, как поведение, заживление ран и развитие органов.