Количественный анализ и характеристика атеросклеротических поражений в синусе аорты мышиной

Общая цель данной процедуры заключается в характеристике и количественной оценке атеросклеротических поражений в синусе аорты при инфаркте миокарда (MI). Для этого сначала проводят диссекцию извлеченного сердца, чтобы отделить апикальную часть и локализовать синус аорты. Затем из обработанной апикальной части сердца готовят парафиновые блоки.

Затем синус аорты разрезают и фиксируют на предметных стеклах. В завершение срезы ткани окрашивают. В итоге с помощью гистохимического и иммуногистохимического анализа можно получить результаты, демонстрирующие различные размеры и состав атеросклеротических поражений.

Процедуру продемонстрирует Даниэль Венга Пеналь, аспирант моей лаборатории. Совет по этике исследований на животных Университета Макмастера предварительно одобрил все описанные здесь процедуры. После анестезии мыши с двойным нокаутом LDLR, забора крови, эвтаназии и фиксации, изолируйте сердце в соответствии с текстовым протоколом; используйте скальпель, чтобы сделать поперечный разрез сердца перпендикулярно восходящей аорте. Поместите апикальную или верхнюю часть сердца в кассету для заливки и погрузите ее в формалин.

Затем поместите кассету в гистологический процессор и проведите обработку в течение ночи. Используя программу, описанную в текстовом протоколе для гистологических форм, расплавьте парафин в течение ночи при 62 °C. Поместите каждую обработанную ткань в глубокую гистологическую форму, убедившись, что поверхность среза сердца прилегает к основанию формы, а затем залейте расплавленным парафином до полного заполнения формы.

Накройте форму маркированной пластиковой кассетой. После охлаждения форм на льду или холодной поверхности извлеките блок из формы для изготовления срезов аорты. Поместите блок в держатель для образцов микротома таким образом, чтобы срезы выполнялись от внутренней части к верхушке сердца.

Установите толщину среза на микротоме на 10 microns и выполните секционирование сердца. Соберите срезы на предметном стекле и изучите их под световым микроскопом для определения положения и ориентации. Синус должен выглядеть как три двухчастных основания клапанов с прикрепленными створками.

Когда становятся видны одна или две створки аортального синуса, при необходимости отрегулируйте угол наклона блока. По достижении створок настройте микротом на резку срезов толщиной 4–5 мкм. Первые 10 срезов закрепите в верхней части отдельных предметных стекол, затем каждую последующую группу из 10 срезов размещайте на следующей позиции.

На предметных стеклах. Продолжайте собирать срезы до тех пор, пока не перестанут обнаруживаться атеросклеротические поражения. Для окрашивания срезов гематилином и эозином с целью визуализации поражений поместите стекла в сушильный шкаф на восемь минут.

Затем проведите депарафинизацию срезов, промывая их ксилолом четыре раза по три минуты. Промойте стекла в 100% этаноле три раза по три минуты. Затем промойте в 70% этаноле и 50% этаноле.

Повторить процедуру трижды по три минуты. Промыть предметные стекла дистиллированной водой, а затем погрузить их в гематин MA на 15 минут.

Промывайте под проточной водопроводной водой в течение пяти минут. Затем, после погружения в раствор эозина Y на период от одной до пяти минут, промойте дистиллированной водой в течение пяти минут.

Промойте дистиллированной водой трижды по пять минут. Затем дважды промойте 50% ethanol по две минуты. После этого промойте 70% ethanol трижды по две минуты, и закончите промывкой 100% ethanol.

Повторить трижды по две минуты. Затем промыть и обработать ксилолом четыре раза по две минуты. Использовать смолу на основе ксилола для заключения срезов и получить изображения с помощью светового микроскопа.

Используйте программное обеспечение для визуализации, чтобы выявить и количественно оценить поражения; их определение может проводиться на определенных расстояниях от аортального синуса с интервалом от 40 до 50 микрон, в зависимости от толщины срезов; инструкции по иммуногистохимическому и иммунофлуоресцентному окрашиванию приведены в текстовом протоколе. Пятинедельным мышам LDLR. Positive скармливали стандартный корм или корм с высоким содержанием жиров в течение 10 недель, после чего их сердца фиксировали, изолировали и подвергали секционированию, как показано здесь.

При кормлении мышей стандартным кормом развитие атеросклероза очень ограничено и может быть незаметно в возрасте 15 недель. Диета с высоким содержанием жиров значительно ускоряет атерогенез в этой модели и вызывает образование крупных развитых поражений, содержащих хронические ацеллюлярные ядра и фиброзные капсулы. Атеросклеротические поражения могут быть дополнительно охарактеризованы путем окрашивания на наличие специфических типов клеток и факторов, определяющих стадии развития поражения.

Инфильтрация моноцитов в интиму представляет собой одно из самых ранних событий атерогенеза интимы. Моноциты дифференцируются в макрофаги, которые поглощают клеточный детрит и липиды. Переполненные липидами макрофаги, известные как пенистые клетки, формируют жировую полоску в стенке артерии, которую мы видим здесь.

Пенистые клетки макрофагов можно обнаружить на всех стадиях развития поражения путем окрашивания антителами к специфическим маркерам макрофагов, таким как F4/80 и MAC-3. Гладкие мышечные клетки сосудов или vSMCs ограничены медиальным слоем здоровой артерии. При развитии запущенного поражения vSMCs начинают мигрировать и пролиферировать в интиме.

Как видно на этой панели, гладкомышечные клетки сосудов можно идентифицировать путем окрашивания антителом к альфа-актину после его экспрессии. Этот метод открыл исследователям в области сердечно-сосудистых заболеваний путь к изучению развития и прогрессирования атеросклеротических поражений у грызунов.