Количественный анализ и характеристика атеросклеротических поражений в синусе аорты мышиной

Общей целью этой процедуры является характеристика и количественная оценка атеросклеротических поражений в синусе аорты ИМ. Это достигается путем предварительного вскрытия удаленного сердца, чтобы отделить апикальную часть и найти аортальный синус. Далее готовят парафиновые блоки с обработанной апикальной частью сердца.

Затем аортальный синус рассекается и устанавливается на предметные стекла. Наконец, срезы тканей окрашиваются. В конечном счете, можно получить результаты, которые показывают различные размеры и состав атеросклеротических поражений с помощью гистохимического и иммуногистохимического анализа.

Демонстрировать процедуру будет Даниэль Венга Пенал, аспирант моей лаборатории. Совет по этике исследований животных Университета Макмастера предварительно одобрил все описанные здесь процедуры: после обезболивания мыши с двойным отрицательным результатом ЛПНП и извлечения крови усыпить и зафиксировать ее перед изоляцией сердца в соответствии с текстовым протоколом, с помощью скальпеля сделать поперечный разрез на сердце перпендикулярно восходящей аорте. Поместите апикальную или верхнюю часть сердца в закладную кассету и погрузите ее в формин.

Затем поместите кассету в тканевый процессор и обрабатывайте в течение ночи. С помощью программы, изложенной в текстовом протоколе для гистологического состава, пресс-формы расплавляют парафин в течение ночи при температуре 62 градуса Цельсия. Поместите каждую технологическую ткань в глубокую гистологическую форму, убедившись, что интерфейс сердца соприкасается с основанием формы, а затем залейте расплавленным парафином, чтобы полностью заполнить форму.

Используйте пластиковую кассету с маркировкой, чтобы накрыть форму. После охлаждения форм на льду или холодной поверхности отделите блок от формы для разреза аорты. Расположите блок в держателе микротома так, чтобы его можно было разрезать изнутри по направлению к верхней части сердца.

Отрегулируйте микротом до 10 мкм и разделите сердце. Соберите срезы на предметном стекле и рассмотрите под световым микроскопом, чтобы определить положение и ориентацию. Пазуха должна выглядеть в виде трех двураздельных оснований клапанов с прикрепленными створками.

Когда один или два клапана аортального синуса становятся очевидными, при необходимости отрегулируйте угол блока. Когда клапаны достигнуты, отрегулируйте микротом так, чтобы разрезать его на четыре-пять микрон. Монтаж первых 10 секций каждая в верхней части отдельных стекол, а затем монтаж каждой последующей группы из 10 секций на следующую позицию.

На горках. Продолжайте собирать срезы до тех пор, пока не будет обнаружено атеросклеротического поражения. Чтобы запачкать срезы гематином и эоином для визуализации поражений, поместите предметные стекла в воздушную сушилку на восемь минут.

Затем депарируйте секции, промыв их с помощью ксилола четыре раза по три минуты каждая. Промойте горки в 100% этаноле три раза по три минуты каждый. Затем 70% этанол и 50% этанол.

Три раза по три минуты каждый. Используйте дистиллированную воду для промывки предметных стекол, а затем погрузите их в воду. Гематин МА в течение 15 минут.

Мойка и запуск. Воду из-под крана в течение пяти минут. Затем промойте и дистиллируйте воду в течение пяти минут после погружения в эоин Y на одну-пять минут.

Промойте и дистиллируйте воду три раза по пять минут. 50%этанол два раза по две минуты. Затем 70% этанол три раза по две минуты каждая стирка, и 100% этанол.

Три раза по две минуты каждый. Затем промыть и ксилол четыре раза по две минуты каждый. Используйте монтажный носитель на основе ксилола для крепления секций и получения изображений под световым микроскопом.

Используйте программное обеспечение для визуализации для идентификации и количественной оценки поражений, которые могут быть определены на определенных расстояниях от аортального синуса с интервалом от 40 до 50 микрон, в зависимости от толщины срезов, обратитесь к текстовому протоколу для иммуногистохимического и иммунофлуоресцентного окрашивания. Пятинедельный ЛДНР. Позитивных мышей кормили стандартной диетой или диетой с высоким содержанием жиров в течение 10 недель, прежде чем их сердца были зафиксированы, изолированы и разделены, как показано здесь.

Когда мышей кормят стандартной диетой, развитие атеросклероза очень ограничено и может не обнаруживаться в течение 15 недель из восьми. Диета с высоким содержанием жиров значительно ускоряет атерогенез в этой модели и индуцирует образование больших распространенных поражений, содержащих хронические бесклеточные ядра и фиброзные колпачки. Атеросклеротические поражения могут быть дополнительно охарактеризованы окрашиванием на наличие определенных типов клеток и факторов, определяющих стадии развития поражения.

Инфильтрация моноцитов в интиму представляет собой одно из самых ранних событий атерогенеза интимы. Моноциты дифференцируются в макрофаги, которые поглощают клеточный мусор и липиды. Набухшие липидами макрофаги, известные как пенистые клетки, создают жировую полосу на стенке артерии, которую видно здесь.

Пенистые макрофагальные клетки могут быть обнаружены на всех стадиях развития поражения путем окрашивания антителами против специфических макрофагальных маркеров, таких как F, четыре, 80 и МАК три. Гладкомышечные клетки сосудов или V SMC ограничены медиальным слоем здоровой артерии. ВСК индуцируются к миграции и пролиферации в интиме во время развития прогрессирующего поражения.

Как видно на этой панели, V-SMC могут быть идентифицированы путем окрашивания антителом против альфа-актина после его развития. Этот метод помог исследователям в области сердечно-сосудистых заболеваний изучить развитие и прогрессирование атеросклеротических поражений в стержнях.