Формирование упорядоченных биомолекулярных структур по самосборки коротких пептидов

Общая цель этой процедуры заключается в создании сборок на основе пептидов в виде биомолекулярных ожерелий. Это достигается путем предварительного приготовления исходных растворов путем растворения дифенилаланина и его защищенного Бахом аналога отдельно в соответствующем количестве HFP до конечной концентрации 100 мг на миллилитр. Второй шаг заключается в смешивании исходных растворов пептидов в соотношении пять к трем путем смешивания 10 микролитров раствора дифенилаланинового пептида с шестью микролитрами защищенного Бахом раствора дифенилаланинового пептида.

Затем смешанный пептидный исходный раствор добавляют к свежеприготовленному 50%-ному этанолу с получением конечной концентрации в пять миллиграммов на миллилитр дифенилаланина и три миллиграмма на миллилитр для защищенного Бахом дифенилаланина соответственно. В конечном счете, сканирующая электронная микроскопия используется для того, чтобы показать биомолекулярные ожерелья, собранные двумя пептидами. Основное преимущество использования процессов самосборки, подобных показанному здесь, заключается в том, что путем спонтанной прогрессии можно создать сложную структуру.

In vitro здесь представлены самосборка пептида, в частности, совместная сборка дипептидов, демонстрирующая эту процедуру нурана, аспиранта бывшей лаборатории. Чтобы начать процедуру самостоятельной сборки Дифенилаланина в трубчатые структуры, приготовьте 100 мг на миллилитр пептидного стокового раствора путем растворения Дифенилаланина пептида в HFP. Чтобы обеспечить однородность раствора, перемешайте его вихревым миксером в течение нескольких секунд и отложите на стол на несколько минут, пока пептид полностью не растворится и раствор не станет прозрачным.

Разведите пептидный стоковый раствор до конечной концентрации два миллиграмма на миллилитр в тройной дистиллированной воде. Выдержите раствор при комнатной температуре в течение 24 часов. Для процедуры совместной сборки растворяют два миллиграмма дифенилаланинового пептида и один миллиграмм защищенного дифенилаланина пептида Баха отдельно в HFP до концентрации 100 мг на миллилитр.

Затем перемешайте растворы вихревым миксером в течение нескольких секунд и отложите их на скамейку на несколько минут, пока пептиды полностью не растворятся, а растворы не станут прозрачными. Смешайте исходные растворы пептидов в соотношении пять к трем, смешав 10 микролитров раствора дифенилаланинового пептида с шестью микролитрами защищенного раствора дифенилаланинового пептида Баха. Затем перемешайте раствор с помощью вихревого миксера.

После этого добавьте восемь микролитров смешанного пептидного исходного раствора к 92 микролитрам свежеприготовленного 50%-ного этанола, чтобы получить конечную концентрацию дифенилаланина в пять миллиграммов на миллилитр и три миллиграмма на миллилитр. Для Баха защищен дифенилаланин. С помощью пипетки аккуратно перемешайте раствор.

После 24 часов инкубации при комнатной температуре нанесите каплю пептидного раствора объемом 10 микролитров на стеклянную крышку и дайте ему высохнуть при комнатной температуре. Нанесите образец на стеклянную крышку стекла тонким слоем золота с помощью распылителя в течение 90 секунд. По завершении создайте образ сборок с помощью SEM, работающего под напряжением от 10 до 20 киловольт.

Для проведения ПЭМ-анализа каплю пептидного раствора объемом 10 мкл поместить на медную сетку размером 200 меш, покрытую углем и стабилизированную полимерной пленочной подложкой. Через минуту удалите лишнюю жидкость с помощью фильтровальной бумаги. Далее перелейте 2%-ный раствор ацетата писсуара в шприц и отфильтруйте его с помощью фильтрующего блока нулевой точки 22 микрометра.

Чтобы удержаться в образце, поместите на сетку каплю 10 микролитров раствора мочеприемникового ацетата. Через 30 секунд удалите лишнюю жидкость с помощью фильтрующей бумаги и отобразите образец на сетке с помощью ПЭМ, работающей под напряжением 120 киловольт. Для ИК-Фурье анализа нанесите каплю 30 микролитров раствора пептида на окно фторида кальция.

Дайте раствору высохнуть при комнатной температуре, чтобы подавить сигнал воды в спектре FTIR. Капните каплю оксида дейтерия на сухой образец пептида. После сушки образца в условиях влагопоглотителя под вакуумом повторите предыдущие шаги дважды, чтобы обеспечить максимальный обмен водорода на дейтерий.

Наконец, запишите спектры ИК-Фурье спектров с помощью детектора дейтерированного сульфата триглицина. Определите минимальные значения коэффициента пропускания с помощью программного обеспечения, входящего в комплект поставки прибора, чтобы продемонстрировать формирование упорядоченных структур путем самостоятельной сборки пептидов. Косборку двух простых ароматических пептидов получали и характеризовали с помощью анализа SEM и TEM.

Смешанные пептиды образовывали архитектуру сферических сборок диаметром в несколько микрон, соединенных вытянутыми структурами диаметром в несколько сотен нанометров благодаря высокому сходству по морфологии с ударами по своим струнам. Эти структуры называются молекулярными ожерельями. FM-анализ этих структур ясно демонстрирует их трехмерное расположение.

Кроме того, СЭМ-анализ разных областей различных образцов свидетельствует о том, что этот процесс происходил с высоким выходом. ИК-Фурье анализ позволяет получить информацию о вторичной структуре сборок пептидов. Абсорбирующий спектр амида.

Одна полоса сферических сборок, образованных защищенным Бахом пептидом дифенилаланина в этаноле, показала один амидный пик на расстоянии 1657 обратных сантиметров, что указывает на подтверждение альфа-спирали. Трубчатые структуры, образованные пептидом дифенилаланина в этаноле, показали два характерных пика на 1 613 обратных сантиметрах и 1 682 обратных сантиметрах, которые коррелируют с бета-листом вторичной структуры. ИК-Фурье спектр биомолекулярных ожерелий, образованных совместной сборкой двух пептидов, отложен от назначения пика для каждого отдельного пептида.

Первый пик на расстоянии 1653 сантиметра соответствует структуре альфа-спирали, а второй пик на 1684 сантиметра соответствует подтверждению бета-поворота. Разница между различными спектрами указывает на уникальную структуру биомолекулярных ожерелий. После просмотра этого видео у вас должно быть хорошее понимание того, как получить сборку на основе пептида с помощью пептида красителя.

Этот метод может быть легко применен к другим биомолекулам с целью формирования сложной структуры. Не забывайте, что ходьба с органическими растворителями может быть чрезвычайно опасной. Перчатки. Во время выполнения этой процедуры всегда следует надевать лабораторный халат и защитные очки.