Трехмерная Tissue Culture моделью для изучения первичного костного мозга человека и его злокачественных новообразований
8 марта 2014 г.
В стандартных методов культивирования клетки берут из их физиологической среде и выращивают на пластиковой поверхности блюдо. Для изучения поведения первичных клеток костного мозга человека, мы создали систему культуры 3-D, где клетки выращиваются в условиях Резюмируя родной микросреду ткани.
Общая цель этой процедуры заключается в создании системы культивирования, которая точно повторяет клеточное и внутриклеточное микроокружение костного мозга человека. Сначала поверхность колодца для тканевой культуры покрывается промышленной матрицей. Затем мононуклеарные клетки костного мозга или другие клетки, представляющие интерес, смешиваются с матриксом костного мозга.
Позже промышленную матрицу удаляют и добавляют смесь клеточной матрицы в лунку. После того, как матрица желеобразная, на нее накладывают питательную среду. В конечном счете, клетки могут быть визуализированы непосредственно в матрице или могут быть выделены для последующего анализа по сравнению с существующими методами культивирования клеток.
Например, стандартные методы культивирования тканей или модели совместной культуры, в которых клетки выращиваются на пластике. Основное преимущество использования метода 3D-культивирования заключается в том, что клетки выращиваются в физиологической микросреде, и, следовательно, это позволяет изучать клетки в естественных условиях ткани. Подготовьте 48 луночную пластину, в которую будут помещены клетки.
Предварительно добавив в каждую по 65 микролитров раствора промышленного покрытия, хорошо распределите раствор равномерно, чтобы покрыть всю поверхность лунки. Этот метод можно масштабировать и на другие поверхности. Дайте планшетам поинкубироваться при комнатной температуре не менее 30 минут.
Тем временем приготовьте клеточную суспензию из 50 000 клеток на микролитр PBS. Приготовьте достаточно, добавьте по 10 микролитров в каждую лунку, затем в пробирке эйнора смешайте клеточную суспензию со 100 микролитрами реконструированного костного матрикса на каждого. Хорошо перемешайте аккуратно и не допускайте появления пузырьков.
Держите смесь на льду, чтобы матрица не загустела, когда пластина закончится. Инкубируя, удалите всю жидкость и нанесите раствор покрытия с помощью аспирации. Затем добавьте в каждую по 100 микролитров хорошо перемешанной клеточной суспензии с матрицей.
Хорошо быстро наклоните пластину с помощью пипетки, чтобы покрыть всю поверхность лунки равномерно. Продолжайте перемешивать суспензию между заполнениями лунок, так как ячейки слипнутся после полной загрузки. Инкубируйте планшет от 30 до 60 минут без перемешивания до тех пор, пока матрица не застынет.
Далее предварительно прогрейте среду для роста костного мозга на водяной бане, установленной до 37 градусов Цельсия. После 30 минут инкубации убедитесь, что матрица схватилась правильно. Хорошая матрица образует мягкий гелеобразный слой, который не смещается при наклоне пластины.
Когда матрица будет готова, аккуратно наложите на нее по каплям миллилитр средства с помощью серологической пипетки. Затем собранную реконструированную культуру костного матрикса возвращают в инкубатор на срок до 30 дней без смены среды. Если требуется смена среды, замените только половину среды за один раз.
Аккуратно удалите среду, не нарушая слой матрицы. Наклоните пластину и аккуратно слейте воду с помощью пипетки. Не аспирируйте средство массовой информации по матрице позже.
При окрашивании клеток. Используйте этот метод для изменения раствора. Для удаления среды из лунок 3D-культуры очень важно, чтобы она была удалена со стороны лунки.
В противном случае матрица будет нарушена, и клетки могут быть потеряны, придерживаясь той же техники. Промыть камеры дважды стерильным XPBS. Затем добавьте в каждую по полмиллилитра ледяного раствора для восстановления камеры.
Хорошо удалите весь слой матрицы вместе с клетками путем энергичного пипетирования вверх и вниз. Для каждого хорошо переложите сбор в микроцентрифужную пробирку и поместите ее на лед. Затем добавьте в ту же лунку еще полмиллилитра восстановительного раствора и соберите весь оставшийся материал.
Закрутите все сборы, и высиживайте их в течение часа на льду. В течение часа делайте вихревые движения по трубкам каждые 15 минут, чтобы облегчить высвобождение клеток из матрицы. Через час проверьте смесь на наличие видимых комочков матрицы.
Их не должно быть, но если они есть, переложите смесь в пробирку большего размера и добавьте еще два-пять миллилитров раствора для восстановления клеток. Затем инкубируйте клетки еще от 30 до 60 минут. Периодически проводите вортекс, и еще раз проверьте на отсутствие комочков матрицы.
Когда матрица больше не комкуется. Центрифугируйте смесь при 1000 об/мин в течение пяти-10 минут при четырех градусах Цельсия. Затем снимите надосадочную жидкость и повторно суспендируйте клеточную гранулу в миллилитре холодного одного XPBS.
Повторите центрифугирование. Замените надосадочную жидкость свежей PBS и повторите стирку. В третий раз.
После третьего промывки PBS восстановите клетки в соответствующем растворе для следующей процедуры. Клетки костного мозга выращивали в реконструированном костном матриксе в течение 30 дней и периодически визуализировали с помощью световой микроскопии при 200-кратном увеличении. Стромальные элементы были впервые обнаружены на пятый день, но они стали отчетливо заметны к 14-му дню.
В течение периода культивирования клетки мигрировали через матрикс и агрегировались в отдельные кластеры. Массы злокачественных клеток расширялись с течением времени, чтобы оценить состав стромальных компонентов, которые перерастают в RBM. Оценена морфология клеток при переходе между RBM и промышленным покрытием.
Клетки окрашивали на фибронектин, актин и ядра. Показано, что клетки визуализации со стромальной морфологией являются преостеообластами с высоким уровнем активности щелочной фосфатазы. Они были способны минерализовать кальций, что определялось по зарину красным окрашиванием, клетки с видимым присутствием липидных капель были идентифицированы как адипоциты на основе положительного окрашивания маслом.
Эритроциты с редкими множественными ядрами были признаны преостеокластами и дали положительный результат на тартрат-резистентную кислую фосфатазу. После выделения клеток из 3D-культуры вы можете делать различные вещи. Например, можно изучать клеточные фенотипы различных клеток, выращенных в микроокружении.
Вы можете изучить экспрессию генов и белков и даже определить, какие молекулы секретируются этими клетками в 3D-условиях.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данной статье представлена система трехмерного (3-D) культивирования, разработанная для изучения первичных клеток костного мозга человека в условиях, имитирующих их естественное микроокружение. Данный метод позволяет осуществлять прямую визуализацию клеток или их выделение для последующего анализа.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Методы культивирования клеток
- Поведение клеток костного мозга
- 3D-тканевая инженерия
Теоретическая часть
- Стандартные методы культивирования часто удаляют клетки из их физиологической среды.
- Клеткам костного мозга требуются специфические условия для сохранения их функциональности.
- Системы 3-D культивирования позволяют лучше воспроизвести условия in vivo.
- Данное исследование направлено на углубление понимания поведения клеток костного мозга.
Цель исследования
- Разработать систему культивирования, которая максимально точно воспроизводит микроокружение костного мозга человека.
- Обеспечить возможность изучения первичных клеток костного мозга человека в более физиологически релевантном контексте.
- Облегчить проведение последующего анализа культивируемых клеток.
Используемые методы
- Покрытие лунок для культивирования тканей промышленным матриксом.
- Смешивание мононуклеарных клеток костного мозга с матриксом костного мозга.
- Удаление промышленного матрикса после желирования.
- Добавление питательной среды поверх смеси клеток с матриксом.
Основные результаты
- Визуализацию клеток можно проводить непосредственно внутри матрицы.
- Изолированные клетки могут быть использованы для различных последующих анализов.
- Система 3-D культивирования улучшает изучение поведения клеток костного мозга.
- Результаты указывают на более высокую физиологическую релевантность по сравнению с традиционными методами.
Выводы
- Разработанная система 3-D культивирования эффективно имитирует среду костного мозга.
- Данный метод может способствовать продвижению исследований функциональной активности клеток костного мозга.
- Будущие исследования могут использовать эту систему для более глубокого изучения гемопоэза.
Часто задаваемые вопросы
Значимость для промышленности
Первичные клетки костного мозга человека трудно поддерживать ex vivo из-за утраты нативных сигналов внеклеточного матрикса, что ограничивает доклиническое моделирование гематологических злокачественных новообразований и стромальных взаимодействий. Система rBM обеспечивает физиологически релевантную 3D-микросреду, которая поддерживает жизнеспособность и функцию первичных клеток костного мозга до 30 дней, позволяя снизить механистические риски при оценке терапевтических кандидатов. Это способствует валидации мишеней и преемственности доклинических исследований за счет сохранения клеточного состава и возможности визуализации поведения клеток и ответа на препараты в матриксе в режиме реального времени.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранний поиск и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет проверять терапевтические гипотезы в условиях, приближенных к нативному стромальному контексту, что проясняет зависимости сигнальных путей в первичном костном мозге человека.
- Практическая ценность: способствует функциональной валидации мишеней за счет сохранения физиологических взаимодействий между клетками и между клетками и матриксом, которые имеют решающее значение для злокачественных и стромальных фенотипов.
- Прогностическая ценность: повышает достоверность результатов связывания с мишенью и фенотипического скрининга за счет снижения количества артефактов, вызванных искусственными условиями культивирования.
Скрининг и разработка анализа
- Готовность анализа: позволяет создавать стандартизированные, воспроизводимые 3D-культуры, подходящие для скрининга соединений с количественным определением выживаемости, пролиферации и морфологии клеток.
- Масштабируемость: совместимость с форматом 48-луночных планшетов и возможность адаптации к высокопроизводительным рабочим процессам для поиска перспективных соединений (lead identification).
- Ценность для скрининга: обеспечивает надежную оценку новых терапевтических средств в релевантной модели заболевания, которая сохраняет гетерогенность первичных клеток и взаимодействие со стромой.
Трансляционные и доклинические исследования
- Трансляционная преемственность: Сохраняет клеточный состав первичного костного мозга здоровых доноров, а также пациентов с амилоидозом и гематологическими злокачественными новообразованиями, что обеспечивает поддержку доклинических исследований, ориентированных на биомаркеры.
- Доклиническая полезность: Позволяет изолировать культивируемые клетки для трансплантации in vivo, проточной цитометрии, анализа нуклеиновых кислот и белков, обеспечивая переход от этапа открытия к этапу валидации.
- Принятие решений с учетом рисков: Облегчает оценку стромально-зависимых эффектов препаратов и механизмов резистентности, что улучшает критерии принятия решения о продолжении или прекращении разработки (go/no-go) на ранних стадиях.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Система rBM вписывается в континуум открытий — от валидации мишени и идентификации ведущих соединений до доклинической оценки, что особенно актуально для гематологических злокачественных новообразований и терапии, зависящей от микроокружения.
- Фундаментальная биология: обеспечивает проверку гипотез и уточнение сигнальных путей путем культивирования первичных клеток костного мозга в микроокружении, воспроизводящем структуру человеческой кости.
- Скрининг: предоставляет количественные и воспроизводимые данные о жизнеспособности клеток, их кластеризации и морфологических изменениях с течением времени, что позволяет проводить сравнительный анализ соединений.
- Аналитика: позволяет осуществлять визуализацию в реальном времени и конечный анализ фенотипов стромальных и злокачественных клеток, включая дифференцировку остеобластов, адипоцитов и остеокластов.
- Трансляционные исследования: обеспечивает преемственность от 3D-культивирования к последующим функциональным анализам, таким как трансплантация и молекулярное профилирование.
- Корпоративное повторное использование: создает универсальную платформу для изучения биологии первичного костного мозга в рамках нескольких проектов и различных терапевтических подходов.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: повышает достоверность прогнозов за счет снижения механистической неопределенности в ответах на препараты, нацеленные на костный мозг.
- Практическая ценность: обеспечивает стандартизированную масштабируемую систему с определенными процедурами подготовки матрикса и поддержания культур.
- Стратегическая ценность: повышает эффективность использования капитала, позволяя на более ранних этапах выявить отсутствие эффективности или неожиданную токсичность в физиологически релевантных моделях.
- Влияние на портфель: способствует приоритизации кандидатов с учетом рисков на основе профилей взаимодействия со стромой и поведения злокачественных клеток в условиях, релевантных для человека.
Рекомендации по внедрению
- Требуется опыт работы с методами 3D-культивирования клеток и манипуляций с внеклеточным матриксом.
- Зависит от наличия реконструированного костного матрикса и соответствующих питательных сред, дополненных человеческой плазмой.
- Необходимо стандартизированное обучение подготовке матрикса, включению клеток и нанесению слоя среды для обеспечения воспроизводимости.
- Требуется адаптация последующих протоколов изоляции для извлечения жизнеспособных клеток из гелевого матрикса без ущерба для их жизнеспособности или фенотипа.
- Ограничено необходимостью избегать замены среды, которая может нарушить структуру матрикса, что требует применения методов осторожной частичной замены среды при необходимости.
