Трехмерная Tissue Culture моделью для изучения первичного костного мозга человека и его злокачественных новообразований
March 8th, 2014
В стандартных методов культивирования клетки берут из их физиологической среде и выращивают на пластиковой поверхности блюдо. Для изучения поведения первичных клеток костного мозга человека, мы создали систему культуры 3-D, где клетки выращиваются в условиях Резюмируя родной микросреду ткани.
Общая цель этой процедуры заключается в создании системы культивирования, которая точно повторяет клеточное и внутриклеточное микроокружение костного мозга человека. Сначала поверхность колодца для тканевой культуры покрывается промышленной матрицей. Затем мононуклеарные клетки костного мозга или другие клетки, представляющие интерес, смешиваются с матриксом костного мозга.
Позже промышленную матрицу удаляют и добавляют смесь клеточной матрицы в лунку. После того, как матрица желеобразная, на нее накладывают питательную среду. В конечном счете, клетки могут быть визуализированы непосредственно в матрице или могут быть выделены для последующего анализа по сравнению с существующими методами культивирования клеток.
Например, стандартные методы культивирования тканей или модели совместной культуры, в которых клетки выращиваются на пластике. Основное преимущество использования метода 3D-культивирования заключается в том, что клетки выращиваются в физиологической микросреде, и, следовательно, это позволяет изучать клетки в естественных условиях ткани. Подготовьте 48 луночную пластину, в которую будут помещены клетки.
Предварительно добавив в каждую по 65 микролитров раствора промышленного покрытия, хорошо распределите раствор равномерно, чтобы покрыть всю поверхность лунки. Этот метод можно масштабировать и на другие поверхности. Дайте планшетам поинкубироваться при комнатной температуре не менее 30 минут.
Тем временем приготовьте клеточную суспензию из 50 000 клеток на микролитр PBS. Приготовьте достаточно, добавьте по 10 микролитров в каждую лунку, затем в пробирке эйнора смешайте клеточную суспензию со 100 микролитрами реконструированного костного матрикса на каждого. Хорошо перемешайте аккуратно и не допускайте появления пузырьков.
Держите смесь на льду, чтобы матрица не загустела, когда пластина закончится. Инкубируя, удалите всю жидкость и нанесите раствор покрытия с помощью аспирации. Затем добавьте в каждую по 100 микролитров хорошо перемешанной клеточной суспензии с матрицей.
Хорошо быстро наклоните пластину с помощью пипетки, чтобы покрыть всю поверхность лунки равномерно. Продолжайте перемешивать суспензию между заполнениями лунок, так как ячейки слипнутся после полной загрузки. Инкубируйте планшет от 30 до 60 минут без перемешивания до тех пор, пока матрица не застынет.
Далее предварительно прогрейте среду для роста костного мозга на водяной бане, установленной до 37 градусов Цельсия. После 30 минут инкубации убедитесь, что матрица схватилась правильно. Хорошая матрица образует мягкий гелеобразный слой, который не смещается при наклоне пластины.
Когда матрица будет готова, аккуратно наложите на нее по каплям миллилитр средства с помощью серологической пипетки. Затем собранную реконструированную культуру костного матрикса возвращают в инкубатор на срок до 30 дней без смены среды. Если требуется смена среды, замените только половину среды за один раз.
Аккуратно удалите среду, не нарушая слой матрицы. Наклоните пластину и аккуратно слейте воду с помощью пипетки. Не аспирируйте средство массовой информации по матрице позже.
При окрашивании клеток. Используйте этот метод для изменения раствора. Для удаления среды из лунок 3D-культуры очень важно, чтобы она была удалена со стороны лунки.
В противном случае матрица будет нарушена, и клетки могут быть потеряны, придерживаясь той же техники. Промыть камеры дважды стерильным XPBS. Затем добавьте в каждую по полмиллилитра ледяного раствора для восстановления камеры.
Хорошо удалите весь слой матрицы вместе с клетками путем энергичного пипетирования вверх и вниз. Для каждого хорошо переложите сбор в микроцентрифужную пробирку и поместите ее на лед. Затем добавьте в ту же лунку еще полмиллилитра восстановительного раствора и соберите весь оставшийся материал.
Закрутите все сборы, и высиживайте их в течение часа на льду. В течение часа делайте вихревые движения по трубкам каждые 15 минут, чтобы облегчить высвобождение клеток из матрицы. Через час проверьте смесь на наличие видимых комочков матрицы.
Их не должно быть, но если они есть, переложите смесь в пробирку большего размера и добавьте еще два-пять миллилитров раствора для восстановления клеток. Затем инкубируйте клетки еще от 30 до 60 минут. Периодически проводите вортекс, и еще раз проверьте на отсутствие комочков матрицы.
Когда матрица больше не комкуется. Центрифугируйте смесь при 1000 об/мин в течение пяти-10 минут при четырех градусах Цельсия. Затем снимите надосадочную жидкость и повторно суспендируйте клеточную гранулу в миллилитре холодного одного XPBS.
Повторите центрифугирование. Замените надосадочную жидкость свежей PBS и повторите стирку. В третий раз.
После третьего промывки PBS восстановите клетки в соответствующем растворе для следующей процедуры. Клетки костного мозга выращивали в реконструированном костном матриксе в течение 30 дней и периодически визуализировали с помощью световой микроскопии при 200-кратном увеличении. Стромальные элементы были впервые обнаружены на пятый день, но они стали отчетливо заметны к 14-му дню.
В течение периода культивирования клетки мигрировали через матрикс и агрегировались в отдельные кластеры. Массы злокачественных клеток расширялись с течением времени, чтобы оценить состав стромальных компонентов, которые перерастают в RBM. Оценена морфология клеток при переходе между RBM и промышленным покрытием.
Клетки окрашивали на фибронектин, актин и ядра. Показано, что клетки визуализации со стромальной морфологией являются преостеообластами с высоким уровнем активности щелочной фосфатазы. Они были способны минерализовать кальций, что определялось по зарину красным окрашиванием, клетки с видимым присутствием липидных капель были идентифицированы как адипоциты на основе положительного окрашивания маслом.
Эритроциты с редкими множественными ядрами были признаны преостеокластами и дали положительный результат на тартрат-резистентную кислую фосфатазу. После выделения клеток из 3D-культуры вы можете делать различные вещи. Например, можно изучать клеточные фенотипы различных клеток, выращенных в микроокружении.
Вы можете изучить экспрессию генов и белков и даже определить, какие молекулы секретируются этими клетками в 3D-условиях.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Обзор
В данной статье представлена система 3-D культуры, разработанная для исследования первичных клеток костного мозга человека в среде, максимально приближенной к их естественной среде обитания. Метод позволяет наблюдать клетки непосредственно или изолировать их для дальнейшего анализа.
Ключевые компоненты исследования
Область науки
- Техники культивирования клеток
- Поведение клеток костного мозга
- 3-D тканевая инженерия
Фон
- Стандартные методы культивирования часто изолируют клетки от их физиологической среды.
- Клетки костного мозга требуют специфических условий для сохранения своей функциональности.
- Системы 3-D культуры могут лучше воспроизводить среду in vivo.
- Данное исследование направлено на улучшение понимания поведения клеток костного мозга.
Цель исследования
- Разработать систему культуры, которая бы максимально приближалась к микроэнвиронменту костного мозга человека.
- Обеспечить возможность исследования первичных клеток костного мозга человека в более физиологически значимом контексте.
- Обеспечить возможность дальнейших анализов культивированных клеток.
Использованные методы
- Покрытие колодцев для культивирования тканей промышленной матрицей.
- Смешивание мононуklearных клеток костного мозга с матрицей костного мозга.
- Удаление промышленной матрицы после застывания.
- Наложение смеси клеток и матрицы на среду роста.
Основные результаты
- Клетки могут быть визуализированы непосредственно в матрице.
- Изолированные клетки могут быть использованы для различных дальнейших анализов.
- Система 3-D культуры улучшает исследование поведения клеток костного мозга.
- Результаты указывают на повышение физиологической значимости по сравнению с традиционными методами.
Выводы
- Разработанная система 3-D культуры эффективно воспроизводит среду костного мозга.
- Этот метод может продвинуть исследования функциональности клеток костного мозга.
- Будущие исследования могут использовать эту систему для более глубокого понимания гемопоеза.
Часто задаваемые вопросы
Executive Industry Relevance
Primary human bone marrow cells are difficult to maintain ex vivo due to loss of native extracellular matrix cues, limiting preclinical modeling of hematologic malignancies and stromal interactions. The rBM system provides a physiologically relevant 3D microenvironment that sustains primary bone marrow viability and function for up to 30 days, enabling mechanistic de-risking of therapeutic candidates. This supports target validation and preclinical continuity by preserving cellular composition and allowing real-time in-matrix visualization of cell behavior and drug response.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses in a native-like stromal context, clarifying pathway dependencies in primary human bone marrow.
- Operational Value: Supports functional target validation by maintaining physiological cell-cell and cell-matrix interactions critical for malignant and stromal phenotypes.
- Predictive Value: Enhances confidence in target engagement and phenotypic screening outcomes by reducing artifacts from artificial culture conditions.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates standardized, reproducible 3D cultures suitable for compound screening with quantitative readouts on cell survival, proliferation, and morphology.
- Scalability: Compatible with 48-well plate formats and adaptable to higher-throughput workflows for lead identification campaigns.
- Screening Value: Enables reliable evaluation of novel therapeutics in a disease-relevant system that preserves primary cell heterogeneity and stromal crosstalk.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Maintains cellular composition of primary bone marrow from normal donors and patients with amyloidosis and hematologic malignancies, supporting biomarker-aligned preclinical studies.
- Preclinical Utility: Allows isolation of cultured cells for in vivo transplantation, flow cytometry, nucleic acid, and protein analysis, bridging discovery to validation.
- Risk-Adjusted Decisions: Facilitates evaluation of stromal-dependent drug effects and resistance mechanisms, improving go/no-go criteria in early development.
Pipeline & Workflow Integration
The rBM system fits within the discovery continuum from target validation through lead identification to preclinical evaluation, particularly for hematologic malignancies and microenvironment-dependent therapies.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by culturing primary bone marrow cells in a microenvironment that recapitulates human bone.
- Screening: Delivers quantitative, reproducible outputs on cell viability, clustering, and morphological changes over time, enabling compound comparison.
- Analytics: Permits real-time visualization and endpoint analysis of stromal and malignant cell phenotypes, including osteoblast, adipocyte, and osteoclast differentiation.
- Translational Research: Enables continuity from 3D culture to downstream functional assays such as transplantation and molecular profiling.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for studying primary bone marrow biology across multiple projects and therapeutic modalities.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by reducing mechanistic ambiguity in bone marrow-targeted drug responses.
- Operational Value: Delivers a standardized, scalable system with defined matrix preparation and culture maintenance procedures.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling earlier detection of lack of efficacy or unexpected toxicity in physiologically relevant models.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of candidates based on stromal interaction profiles and malignant cell behavior in human-relevant conditions.
Implementation Considerations
- Requires expertise in 3D cell culture techniques and extracellular matrix handling.
- Dependent on access to reconstructed bone matrix and appropriate growth media supplemented with human plasma.
- Necessitates standardized training for matrix preparation, cell embedding, and medium overlay to ensure reproducibility.
- Requires adaptation of downstream isolation protocols to recover viable cells from the gel matrix without compromising viability or phenotype.
- Limited by the need to avoid medium changes that disturb the matrix, requiring careful half-medium exchange techniques when necessary.
