Выделение нуклеиновых кислот из дрожжей

Сегодня мы продемонстрируем вам способ очистки нуклеиновых кислот из Saccharomyces cerevisiae, также известных как пекарские дрожжи. К нуклеиновым кислотам относятся ДНК или РНК. В данном видео будет рассмотрен процесс выделения этих молекул из дрожжевых клеток с помощью фазового разделения и хроматографии.

Хотя существует множество различных методов очистки нуклеиновых кислот из дрожжей, большинство из них имеют одинаковые начальные этапы.

Сначала клетки дрожжей размножают, отбирая одну колонию с чашки и инокулируя ее в среду YPD. Смесь следует выращивать в течение ночи при 30 °C в шейкере или ротационном инкубаторе.

Для оптимизации выхода клетки дрожжей следует собирать в середине логарифмической фазы роста. Дрожжи в логарифмической фазе роста обычно имеют значение оптической плотности или "OD" от 0.5-1 при измерении на длине волны 600 nm. После достижения клетками соответствующей оптической плотности их центрифугируют для получения осадка и ресуспендируют в лизирующем буфере для разрушения клеток.

Одним из наиболее сложных аспектов выделения нуклеиновых кислот из дрожжей является разрушение их прочных клеточных стенок. Клеточные стенки можно разрушить с помощью сочетания ферментативных и физических методов. Разрушение клеточной стенки приводит к образованию сферических клеток, называемых сферопластами, которые можно лизировать с помощью стандартных методов лизиса клеток.

Сферопласты обычно лизируют с помощью химических детергентов, таких как додецилсульфат натрия или SDS, которые разрушают клеточные мембраны. Клетки также можно гомогенизировать. Например, к клеткам можно добавить стеклянные шарики и гомогенизировать их с помощью вортекса. Также для облегчения процесса лизиса клеточные стенки можно разрушить ультравысокочастотным звуком с помощью соникатора.

Как уже упоминалось, все процедуры очистки нуклеиновых кислот из дрожжей включают схожие этапы выращивания, сбора и лизиса дрожжевых клеток, однако после лизиса клеток для выделения нуклеиновых кислот можно использовать несколько различных методов. Нуклеиновые кислоты могут быть очищены с помощью колоночного связывания или фазового разделения.

ДНК и РНК лучше всего выделять с использованием связывания на силикатных колонках. Нуклеиновые кислоты связываются с колонкой посредством anion exchange и могут быть элюированы из колонки после отделения от других клеточных компонентов.

Фазовое разделение основано на принципе, согласно которому растворы с различными свойствами могут быть использованы для очистки или концентрирования определенных белков или нуклеиновых кислот в зависимости от их растворимости. Добавление хлороформа разделяет суспензию клеточных компонентов на две разные фазы: водную и органическую. Органическая фаза содержит белки, а водная фаза содержит нуклеиновые кислоты. Затем ДНК может быть осаждена из водной фазы путем добавления этанола.

Нуклеиновые кислоты могут быть выделены из дрожжей с использованием протокола сорбции на колонке. Сначала клетки выращивают и собирают путем центрифугирования.

Супернатант удаляют и утилизируют, а осадок клеток ресуспендируют в буфере, содержащем ферменты, перемешивают на вортексе и инкубируют до расщепления клеточных стенок. При оптимизации ферментативной обработки расщепление клеточных стенок и образование сферопластов можно подтвердить с помощью микроскопии. После расщепления клеточных стенок в клетки добавляют лизирующий буфер, и смесь перемешивают на вортексе.

Лизированые клетки центрифугируют для очистки смеси от клеточного дебриса, в результате чего ДНК, мелкие частицы и растворимые белки остаются в супернатанте. Супернатант наносят на силикатную колонку, после чего при центрифугировании нуклеиновые кислоты связываются с сорбентом, что позволяет удалить основную массу растворимых примесей.

Этапы промывки проводят с использованием этанола или буфера с высоким содержанием соли для удаления остаточных примесей из связанных нуклеиновых кислот. В завершение ДНК или РНК элюируют водой или буфером с низким содержанием соли. Убедитесь, что используемый буфер или вода не содержат ферментов DNAse и RNAse.

Нуклеиновые кислоты, выделенные из дрожжей, находят разнообразное применение в зависимости от конкретной экспериментальной цели. ДНК, выделенная из дрожжей, может быть использована в ряде различных методов молекулярной биологии, включая: ПЦР, саузерн-блоттинг или рестрикционный анализ.

Изменения в экспрессии генов могут быть выявлены с помощью метода, известного как микрочиповый анализ, в котором используются генные матрицы, подобные этой.

Если имеются две культуры дрожжей, одна из которых подвергалась воздействию перекиси водорода, а другая является контрольной, из этих культур можно выделить мРНК и провести гибридизацию на микрочиповых стеклах. Затем стекла анализируются, что позволяет идентифицировать гены, модифицированные окислительным стрессом.

В данном видео исследователи используют роботизированную систему для создания библиотеки общегеномных мутантов дрожжей, которые применяются для оценки функций генов. Благодаря встраиванию в гены специально сконструированных последовательностей, называемых генетическими штрихкодами, геномную ДНК мутантных штаммов можно извлекать из 4 000–6 000 отдельных образцов одновременно с последующим микрочиповым анализом или секвенированием. На основе относительного содержания последовательностей штрихкодов можно определить жизнеспособность каждого мутанта при различных экспериментальных условиях.

Вы только что посмотрели видео JoVE по выделению нуклеиновых кислот из дрожжей. Теперь вы должны понимать основные аспекты очистки нуклеиновых кислот, например, то, как подготовить клетки дрожжей к лизису и как проводить различные процедуры экстракции и выделения. Как всегда, спасибо за просмотр!