Костного мозга, полученных макрофагов производства

Общая цель этой процедуры заключается в получении макрофагов из мочи и клеточных культур, полученных из костного мозга. Это достигается в первую очередь путем извлечения костного мозга из задних лап мыши. На втором этапе резидентные макрофаги костного мозга удаляются, а затем клетки костного мозга дополнительно культивируются в условиях дифференцировки макрофагов.

Затем, когда клетки костного мозга дифференцируются в макрофаги, их можно собирать для экспериментального анализа. В конечном счете, конфокальная микроскопия может быть использована для демонстрации локализации бактериального ЛПС в макрофагах, полученных из костного мозга, в конечных кислотных компартментах. Основное преимущество этой методики перед существующими методами выращивания макрофагов, клеточных линий, заключается в том, что их большое количество, поэтому можно получить первичные макрофаги.

Визуальная демонстрация метода имеет решающее значение, так как этапы самостоятельного производства сложны в освоении и требуют практики, и для достижения успеха продезинфицируйте кожу усыпленной мыши с помощью 70% этанола. Сделайте надрез в верхней части каждой задней ноги и потяните кожу вниз к ступне, чтобы обнажить мышцу. Далее отрежьте задние лапы и используйте стерильные ножницы и щипцы.

Чтобы снять кожу, поместите ноги в стерильную 35-миллиметровую чашку Петри, содержащую пять миллилитров стерильного льда. Холодный PBS. Удалите всю кожу и мышцы, прикрепленные к костям, а затем переложите кости в новую стерильную чашку Петри, содержащую пять миллилитров льда.

Холодные, стерильные ПБС. Промойте кости дважды еще пятью миллилитрами PBS, а затем переложите их в стерильную ступку, содержащую пять миллилитров льда. Холодные, стерильные ПБС.

Теперь отрежьте большеберцовую кость от бедренной кости по суставу и с помощью пестика аккуратно разомните кости. Соберите надосадочную жидкость в ледяные 15 миллилитровые пробирки трижды. Затем отфильтровать тканевую суспензию через сетчатое фильтр из нейлоновых элементов размером 70 микрон.

Чтобы удалить твердые фрагменты, открутите фильтрат вниз и аккуратно выбросьте надосадочную жидкость. Диссоциируем гранулу с буфером для лизиса эритроцитов, добавляя 20 миллилитров ледяного полного DMEM, через 30 секунд для остановки реакции после центрифугирования клеток, суспензируем гранулу в 20 миллилитрах 37 градусов Цельсия, завершаем DMEM, а затем разделяем клеточную суспензию между двумя 100-миллиметровыми чашками Петри. Инкубируйте посуду в течение четырех часов при температуре 37 градусов Цельсия, а затем соберите надосадочную жидкость в 50 миллилитровые пробирки комнатной температуры.

После откручивания надосадочной жидкости повторно суспендируйте гранулу в 10 миллилитрах полного DMEM с добавлением ранее приготовленного надосадочной жидкости L 9 29, а затем отфильтруйте клетки через нейлоновое сетчатое фильтр 40 микрон. Добавьте фильтрат в 140 миллилитров полной DMEM и L 9 29 клеточной среды, а затем распределите по 10 миллилитров клеточной суспензии на чашку в 15 100-миллиметровых чашках Петри. После инкубации клеток в течение трех дней при 37 градусах Цельсия и 5% углекислом газе при 10 миллилитрах полного надосадочной жидкости DMEM плюс L 9 29 инкубируйте клетки еще четыре дня.

Периодический мониторинг роста клеток с помощью инвертированного микроскопа для забора макрофагов из костного мозга сначала аспират и отбрасывание надосадочной жидкости. Затем вымойте чашки Петри два раза полным ДМЭМ. Затем добавьте пять миллилитров 37 градусов Цельсия в полный DMEM и с помощью резинового полицейского аккуратно отделите клетки, соберите макрофаги, полученные из костного мозга, в 50-миллилитровые пробирки, а затем раскрутите клетки.

Резус суспендирует гранулы в 20 миллилитрах полного DMEM. Наконец, подсчитайте ячейки по триамному синему исключению. Используя этот метод, можно получить большое количество макрофагов всего за несколько дней после выделения и покрытия круглых неадгезивных клеток костного мозга за вычетом резидентных макрофагов костного мозга, как показано выше.

Эти репрезентативные клетки-предшественники BMDM инкубировали с G-M-C-S-F. Через три дня клетки начали адгезировать и дифференцироваться в макрофаги. Через семь дней наблюдался сливающийся монослой макрофагов, полученных из костного мозга.

Проточный цитометрический анализ для F 4 80 и H-L-A-D-R показал, что макрофаги, полученные из костного мозга, экспрессируют оба маркера, подтверждающие дифференцировку клеток костного мозга в макрофаги. Оценить кислотные возможности PHA макрофагов костного мозга, полученных от него. Способность клеток усваивать скорость латекса контролировалась, как и ожидалось.

Было определено, что количество бусин в клетке со временем увеличивается для оценки их эндоцитарного потенциала. Макрофаги, полученные из костного мозга, также культивировали совместно с коксиеллой. Было замечено, что ЛПС глаза Бернетта красным цветом локализован в компартменте, содержащем лизосомально-ассоциированный мембранный белок (один синего цвета, но не катепсин D) зеленого цвета, что свидетельствует о том, что ЛПС присутствует в поздних эндосомах, которые не могут сливаться с лизосомами, как и ожидалось, макрофагами, полученными из костного мозга.

Взаимодействие бактериальных патогенов было дополнительно проанализировано через их заражение глазом TMA Wiley. Как и ожидалось, бактерии, выделенные красным цветом, не были локализованы в отсеке, в котором находятся KPS и D, которые снова отображаются зеленым цветом. В этом репрезентативном иммуноблоттинге были оценены пути передачи сигнального сигнала макрофагов костного мозга, демонстрирующие, что макрофаги, полученные из костного мозга, такие как ткань, выделенные макрофаги повышают уровни фосфорилированной киназы альфа-карты P 38 в ответ на стимуляцию ЛПС esia coli.

Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области клеточной микробиологии, например, к какому внутриклеточному компартменту локализуется микрокомпартмент.