Агроинфильтрация и PVX Агроинфекция в картофель и Никотиана бентамиана

Общая цель данного эксперимента состоит в том, чтобы проверить, распознаются ли эффекторы патогенов устойчивыми белками в растениях. Это достигается путем предварительного заражения листьев растений жидкой культурой агробактерий или через агроинфекцию PVX, которая будет временно экспрессировать эффекторы в тканях растения. Затем растениям дают инкубироваться, и растения оценивают на гибель клеток.

Получены результаты, показывающие реакцию на гибель клеток при распознавании временно экспрессируемых перебежчиков белками резистентности у растений. Основное преимущество этих методик перед существующими методами, такими как генетические исследования с молекулярными маркерами, заключается в том, что это функциональные анализы. Они не только показывают, что ген устойчивости присутствует в растении, но и что он работает и что защитные реакции активно индуцируются.

Эти методы могут помочь ответить на ключевые вопросы молекулярной патологии растений, такие как быстрое обнаружение устойчивости ботов и генов РА и уголовных болезней AFI, наличие которых у обеих последовательностей генома Демонстрация процедуры будет выполнена du, аспирантом из лаборатории Для создания растений картофеля. Выращивание растений in vitro в стерильных пластиковых банках, содержащих большее количество шиге, скуга или среды рассеянного склероза, в климатических камерах при температуре 18 градусов Цельсия с 16-часовым восьмичасовым дневным ночным режимом в течение двух недель. Когда растения подрастают, белые корни переносят их в горшки со стерилизованной почвой.

В регулируемых тепличных отсеках для растений, используемых в этих экспериментах, используются четырех-пятинедельные семена, выращенные NCOA hamana, и четырех-пятинедельные саженцы картофеля, полученные in vitro. Готовить агробактериальную культуру начинают с заполнения 50 миллилитровых пробирок 10 миллилитрами среды YEB, дополненной одним микролитром ацетофенона, 100 микролитрами MES и соответствующими антибиотиками. Далее пипеткой вводят 20 микролитров глицеринового запаса нужных штаммов агробактерий, содержащих интересующий ген, в YEB.

Инкубируйте культуры при температуре 28 градусов Цельсия и 200 об/мин в течение одного-двух дней до наружного диаметра 600 около 1,0. Соберите клетки центрифугированием при давлении 3000 GS в течение 10 минут. Затем слейте супернат и снова суспендируйте гранулу.

В свежеприготовленных ММА средний до OD 600 0,3. Осторожно переведите клетки в вихрь, чтобы восстановить их суспензию для совместной инфильтрации двух бактериальных штаммов. Смешайте культуру в соотношении один к одному.

Дайте культурам постоять при комнатной температуре от одного до шести часов, прежде чем проникать в растения. Тем временем пометьте растения, которые будут инфильтрированы, штаммом и дату проведения эксперимента для проведения инфильтрации, надев защитные очки. С помощью одномиллилитрового шприца без иглы осторожно и медленно вводите суспензии агробактерий в листовые панели.

Вносите не менее трех растений и трех листьев на растение, чтобы они служили тройками, чтобы избежать перекрестного заражения. Меняйте или стерилизуйте перчатки между инфильтрациями и не поливайте растения до следующего дня. После инокуляции примерно через три дня после инфильтрации оцените растения на гибель клеток по шкале от нуля до 100%, где ноль означает отсутствие симптомов.

100%указывает на конфлюенсную гибель клеток и промежуточные значения, варьирующиеся от склероза до возрастающих уровней гибели клеток. Проведите агроинфекцию PVX у двух-трехнедельных растений и растений, выращенных из семян хамана, и двух-трехнедельных пересадках картофеля, выращенных in vitro, до трех миллилитров YEB с добавлением антибиотиков. Добавьте 20 микролитров глицеринового запаса агробактерий, инкубируйте при 28 градусах Цельсия и 200 оборотах в минуту до наружного диаметра 600 около 1,0.

Разложите около 300 микролитров каждого штамма агробактерии на агаровые пластины LB с антибиотиками и инкубируйте при температуре 28 градусов Цельсия в течение одного-двух дней. Используйте шпатель для сбора агробактерии. Затем следует привить лист с большим количеством бактерий.

Опустите зубочистку в культуру и с ее помощью проткните растение. Прививайте каждый лист в нескольких местах через листья на растение и три растения на сорт. Через две недели после прививки оцените макроскопически, качественно записав каждое пятно как «да» или «нет».

Затем рассчитайте процент ответивших сайтов и сравните с показанными элементами управления. Вот репрезентативные результаты агроинфильтрации в конце hamana и двух сортах картофеля, Solenium JI 3 49 dash three и CV Desiree примерно через три дня после инокуляции. Происходит слияние клеточной гибели в листовой панели, инфильтрированной смесью агробактерии штамма AGL одного PVRG, содержащего P bin плюс R три A и PK семь WG два A VR три A , при этом смертельного ответа не происходит при отрицательном контроле PI плюс R три A или PK семь WG два A VR три A на этом рисунке PVX агроинфекция n и два вида картофеля S один Kae 3 54 dash one и S micro DOUM 360 dash one показаны примерно через две недели после прививки.

Происходит расширение клеточной гибели в местах, инокулированных положительным контролем PGR 1 0 6 CRN two. Он кодирует ген, вызывающий общую гибель клеток от Phytophthora Infest и PGR 1 0 6 в одном, который кодирует ген от P Infest. Гибель расширяющихся клеток не наблюдается на участке, инокулированном отрицательным контролем PGR 1 0 6 пустой лунки.

При попытке выполнить эту процедуру важно помнить о выращивании растительного материала хорошего качества. Этот метод проложил путь к изучению омики эффектов в картофеле и других видах растений для исследователей в области молекулярной патологии растений и селекции растений. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее понимание того, как проводить эффективный и надежный высокопроизводительный функциональный анализ гена can у растений.