Сотовый Сжатие как Robust, микрофлюидных внутриклеточного Delivery Platform

Общая цель эксперимента с падением заключается в том, чтобы доставить макромолекулы вектора в свободном доступе к клеткам-мишеням с помощью механического разрушения. Это достигается путем предварительного помещения целевого типа клетки в суспензию с нужным материалом доставки и загрузки в резервуар специально разработанного микрофлюидного устройства. На втором этапе микрофлюидное устройство подвергается давлению, и клетки пропускаются через массив микрофлюидных каналов, которые сжимают клетки, способствуя временному разрушению мембраны.

Затем клеткам дают инкубироваться в присутствии целевого материала для доставки для облегчения диффузионного транспорта материала в цитоплазму клетки. Пока клеточная мембрана восстанавливается. Получены результаты, показывающие эффективную доставку макромолекул с помощью проточной цитометрии.

Основное преимущество этой техники перед существующими методами, такими как коррекция и липосовершенствование, заключается в том, что она способна работать со сложными типами клеток и материалами, которые не могут быть эффективно доставлены другими методами. Этот метод может ответить на ключевые вопросы в биологической области, например, как улучшить перепрограммирование клеток. Применение этого метода распространяется на терапию и диагностику рака, поскольку система позволяет манипулировать иммунными клетками для повышения их противоопухолевой эффективности.

Для начала изготовьте или приобретите микрофлюидное устройство, держатель устройства, пластиковые резервуары для жидкости и уплотнительные кольца, показанные здесь и перечисленные с подробной информацией в сопроводительном текстовом протоколе, затем заполните три герметичных контейнера наполовину 70% этанолом. Поместите устройства в первый контейнер, резервуары и уплотнительные кольца во второй контейнер и держатели в третий. Затем заполните контейнеры до конца 70% этанолом.

Далее поместите контейнер с резервуарами и уплотнительными кольцами, а также контейнер с держателями в ультразвуковую ванну на пять-10 минут перед использованием. Это поможет удалить любые загрязняющие частицы из предыдущих экспериментов, в то время как компонентный ультразвук протирает рабочее место в шкафу биобезопасности 70% этанолом. Затем простерилизуйте все необходимые материалы, включая три контейнера и пару пинцетов, протерев их 70% этанолом, и поместите их в шкаф биобезопасности, чтобы начать сборку.

Во-первых, положите две-три салфетки с низким ворсом в рабочей зоне. Затем извлеките пластиковые емкости из емкости с этанолом с помощью пинцета и установите их на салфетки, чтобы облегчить впитывание и испарение этанола с ее внутренней поверхности. Осторожно постучите по резервуарам, чтобы удалить раствор этанола.

При необходимости используйте газ под давлением для полной продувки резервуара. Как только резервуары высохнут, вставьте уплотнительные кольца в соответствующие пазы на резервуарах. Затем с помощью пинцета поместите чип лицевой стороной вверх в держатель устройства.

Убедитесь, что чип лежит ровно в держателе, и при необходимости отрегулируйте с помощью пинцета. Если устройство не поместится должным образом в держателе, есть риск, что оно сломается во время последующих действий. Далее аккуратно поместите резервуары на держатель и совместите их с зажимами.

Следите за тем, чтобы уплотнительные кольца не выпали из своих пазов. Во время этого процесса аккуратно надавливайте на резервуары до щелчка. Убедитесь, что обе стороны резервуаров надежно закреплены и что чип находится в правильном положении.

Не давите на резервуары с чрезмерной силой. Так как давление может сломать стружку для первичного или прилипания. Клеточные линии, размещайте клетки за один-два дня до эксперимента так, чтобы их слияние не превышало 80%.

В день проведения эксперимента. Непосредственно перед экспериментом соберите клетки и ресуз, суспендируйте их в среде или другом желаемом буфере в концентрации от одного до 10 миллионов клеток на миллилитр. Затем осторожно пропустите клеточную суспензию через сетку клеточного фильтра размером 40 микрон, чтобы предотвратить засорение устройства скоплениями клеток и матриксом.

После процеживания смешать 300 микролитров клеточной суспензии с нужной концентрацией материала доставки в отдельной пробирке. Для этой демонстрации два микролитра декстрина в соотношении пять миллиграммов на миллилитр и два микролитра Alexa. 4 На 50 микролитров клеточной суспензии добавляют 88 антител для контроля изотопов.

Далее аккуратно перемешайте 100 микролитров клеток с помощью пипетирования. Затем с помощью гелевых наконечников насадки нажмите ячейки и материал для доставки в любой из резервуаров, прикрепите напорную трубку к заполненному резервуару и затяните узел пальцами, чтобы обеспечить надлежащий потолок. Затем отрегулируйте давление воздуха до 70 фунтов на квадратный дюйм на регуляторе, чтобы контролировать скорость, с которой ячейки проходят через устройство.

Давление должно быть оптимизировано для конкретной комбинации клетки и микрофлюидного чипа, используемой в каждом эксперименте. Когда все подготовило, поднимите устройство на уровень глаз и сориентируйте его так, чтобы жидкость в резервуаре была хорошо видна. Затем нажмите кнопочный клапан, чтобы создать давление в резервуаре и начать поток ячеек.

Следите за скоростью, с которой жидкость вытекает из резервуара. Если скорость потока жидкости значительно замедляется по сравнению с начальной скоростью потока, скорее всего, смонтированное устройство засорено и его необходимо заменить. Повышенный сдвиг, вызванный закупоркой, приведет к более значительной, чем обычно, гибели клеток.

Когда уровень жидкости окажется примерно в двух миллиметрах от дна водоема, быстро поверните регулятор на ноль PSI, чтобы остановить поток. Важно остановить поток воздуха до того, как резервуар будет опорожнен, иначе проба может быть выброшена из резервуара для сбора. Затем соберите обработанные клетки из резервуара для оттока и поместите их в микроцентрифужную пробирку.

При комнатной температуре номинальные элементы будут продолжать поглощать материал в течение 10 минут. Через 10 минут нанесите на клетки дополнительную среду или продолжайте использовать клетки в соответствии с экспериментальными потребностями. Повторите эти шаги, чтобы собрать столько обработанных клеток, сколько необходимо, и замените чипы по мере необходимости, если они засоряются, и выбросьте забитые C устройства для каждого последующего образца.

Измените направление потока, чтобы свести к минимуму эффект засорения. Когда закончите сбор ячеек, аккуратно отсоедините резервуары от основного держателя, отодвинув в сторону рычаги зажима. Затем поместите каждую деталь для повторного использования в соответствующий контейнер для хранения и заполните их свежим 70% этанолом.

Окончательно поместите всю использованную стружку в отдельную емкость для правильной утилизации. Измеряли эффективность доставки и жизнеспособность клеток hela. После серии экспериментов три различных микрофлюидных чипа были протестированы в диапазоне скоростей до 600 миллиметров в секунду.

Эти тесты показали, что увеличение скорости потока улучшает доставку флуоресцентно сопряженного трехкилодальтонного декстрина в ячейки для каждого из протестированных чипов. Кроме того, увеличение скорости также привело к снижению жизнеспособности ячеек примерно на 20% в протестированных устройствах. Этот уровень гибели клеток относительно низок и часто намного выше в неправильно спроектированных устройствах.

Поглощение конъюгированного декстрина тихоокеанской синей в популяцию контрольных клеток, показанное слева, является результатом ограниченного поверхностного связывания и эндоцитарных эффектов. Так как клетки подвергаются воздействию материала доставки в течение того же времени, что и обработанные клетки. Справа представлена популяция живых клеток, которые проходят через микрофлюидное устройство, подвергаясь воздействию той же концентрации декстрина, что и контрольные клетки.

Ячейки в затененной области считаются недоставленными, а ячейки справа от линии определяются как доставленные. После освоения этой техники она может быть выполнена менее чем за один час, если она выполнена правильно. После этой процедуры могут быть проведены другие методы, постоптометрия жизни, чтобы ответить на дополнительные вопросы, такие как эффективность доставки и функциональность материала после его разработки.

Этот метод проложил путь исследователям в области регенеративной медицины к изучению клеточного программирования в первичных клетках взрослого человека с использованием прямой доставки белка. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как настроить и эксплуатировать систему самосжатия для желаемого приложения.