Сотовый Сжатие как Robust, микрофлюидных внутриклеточного Delivery Platform
7 ноября 2013 г.
Быстрое механическая деформация клеток стала перспективный, векторные без метода внутриклеточной доставки макромолекул и наноматериалов. Этот протокол содержит подробные шаги, как использовать систему для широкого спектра приложений.
Общая цель эксперимента по методу «падения» (falling experiment) заключается в доставке макромолекул в целевые клетки без использования векторов посредством механического воздействия. Это достигается путем первоначального помещения целевого типа клеток в суспензию с необходимым материалом для доставки и загрузки этой смеси в резервуар специально разработанного микрофлюидного устройства. На втором этапе в микрофлюидном устройстве создается давление, и клетки проходят через массив микрофлюидных каналов, которые сжимают клетки для обеспечения кратковременного нарушения целостности мембраны.
Затем клетки инкубируют в присутствии материала для доставки мишени, чтобы облегчить диффузионный транспорт материала в цитоплазму клеток. В это время происходит восстановление клеточной мембраны. Результаты, полученные с помощью проточной цитометрии, подтверждают эффективную доставку макромолекул.
Основным преимуществом данного метода по сравнению с существующими подходами, такими как электропорация и липофекция, является его способность воздействовать на труднодоступные типы клеток и материалы, которые невозможно эффективно доставить другими способами. Этот метод позволяет ответить на ключевые вопросы в области биологии, например, о том, как улучшить репрограммирование клеток. Значимость данной методики распространяется на терапию и диагностику рака, поскольку система позволяет манипулировать иммунными клетками для повышения их противоопухолевой эффективности.
Для начала изготовьте или приобретите микрофлюидное устройство, держатель устройства, пластиковые резервуары для жидкости и уплотнительные кольца, показанные здесь и подробно описанные в сопровождающем текстовом протоколе, затем частично заполните три герметичных контейнера 70% ethanol. Поместите устройства в первый контейнер, резервуары и уплотнительные кольца во второй, а держатели в третий. Затем долейте в контейнеры 70% ethanol до полного заполнения.
Затем поместите контейнер с резервуарами и уплотнительными кольцами, а также контейнер с держателями в ультразвуковую баню на 5–10 минут перед использованием. Это поможет удалить любые загрязняющие частицы от предыдущих экспериментов, пока компоненты подвергаются соникации; в это время протрите рабочую поверхность в боксе биологической безопасности 70% ethanol. Затем стерилизуйте все необходимые материалы, включая три контейнера и пинцет, протерев их 70% ethanol, и поместите их внутрь бокса биологической безопасности для начала сборки.
Сначала положите две или три салфетки с низким содержанием ворса в рабочую зону. Затем с помощью пинцета извлеките пластиковые резервуары из контейнера с этанолом и поместите их на салфетки, чтобы облегчить впитывание и испарение этанола с их внутренней поверхности. Осторожно постучите по резервуарам, чтобы помочь удалению раствора этанола.
При необходимости используйте сжатый газ для полной продувки резервуара. После высыхания резервуаров вставьте уплотнительные кольца в соответствующие пазы на резервуарах. Затем с помощью пинцета поместите чип лицевой стороной вверх в держатель устройства.
Убедитесь, что чип плотно прилегает к держателю, и при необходимости поправьте его с помощью пинцета. Если устройство improperly установлено в держателе, существует риск его повреждения на последующих этапах. Затем аккуратно поместите резервуары на держатель и совместите их с зажимами.
Следите за тем, чтобы уплотнительные кольца не выпали из своих пазов. В ходе этого процесса осторожно нажмите на резервуары до щелчка. Убедитесь, что обе стороны резервуаров надежно зафиксированы и чип находится в правильном положении.
Не нажимайте на резервуары с чрезмерной силой, так как давление может привести к повреждению чипов для первичных или адгезивных клеточных линий. Посейте клетки за один-два дня до начала эксперимента, чтобы степень их конфлюэнтности не превышала 80%.
В день проведения эксперимента. Непосредственно перед началом эксперимента соберите клетки и ресуспендируйте их в среде или другом подходящем буфере до концентрации от 1 до 10 миллионов клеток на миллилитр. Затем осторожно пропустите клеточную суспензию через клеточный фильтр с размером пор 40 мкм, чтобы предотвратить засорение устройства комками клеток и матрикса.
После фильтрации в отдельную пробирку смешали 300 µL клеточной суспензии с материалом для доставки в требуемой концентрации. Для данной демонстрации на каждые 50 µL клеточной суспензии добавляют 2 µL декстрина в концентрации 5 mg/mL и 2 µL контрольных антител Alexa 488.
Затем осторожно перемешайте 100 µL клеток путем пипетирования. После этого с помощью наконечников для нанесения образцов на гель перенесите клетки и материал для доставки в один из резервуаров, подсоедините трубку подачи давления к заполненному резервуару и затяните зажим пальцами, чтобы обеспечить герметичность. Затем установите давление воздуха на регуляторе на уровень 70 PSI, чтобы контролировать скорость перемещения клеток через устройство.
Давление следует оптимизировать для конкретной комбинации клеток и микрофлюидного чипа, используемой в каждом эксперименте. После завершения всех подготовительных действий поднимите устройство на уровень глаз и расположите его так, чтобы жидкость в резервуаре была хорошо видна. Затем нажмите на кнопку клапана, чтобы создать давление в резервуаре и начать поток клеток.
Следите за скоростью вытекания жидкости из резервуара. Если поток жидкости существенно замедлится по сравнению с начальной скоростью, это, вероятно, означает, что установленное устройство засорилось и требует замены. Повышенное напряжение сдвига, вызванное засором, приведет к более высокой, чем в норме, гибели клеток.
Когда уровень жидкости достигнет примерно двух миллиметров от дна резервуара, быстро поверните регулятор на 0 PSI, чтобы остановить поток. Важно прекратить подачу воздуха до того, как резервуар полностью опустеет, иначе образец может быть выброшен из приемного резервуара. Затем соберите обработанные клетки из выходного резервуара и перенесите их в микроцентрифужную пробирку.
При комнатной температуре маркированные клетки будут продолжать поглощать материал в течение до 10 минут. По истечении 10 минут высейте клетки с добавлением среды или приступайте к использованию клеток в соответствии с требованиями эксперимента. Повторите эти действия, чтобы собрать необходимое количество обработанных клеток; при необходимости замените чипы, если они засорятся, и утилизируйте засорившиеся устройства для каждого последующего образца.
Измените направление потока, чтобы минимизировать риск засорения. По завершении сбора клеток аккуратно отсоедините резервуары от основного держателя, отодвинув зажимы. Затем поместите каждую деталь, предназначенную для повторного использования, в соответствующий контейнер для хранения и заполните их свежим 70% ethanol.
Наконец, поместите все использованные чипы в отдельный контейнер для надлежащей утилизации. Были измерены эффективность доставки и жизнеспособность клеток HeLa. В ходе серии экспериментов были протестированы три различных микрофлюидных чипа в диапазоне скоростей до 600 millimeters per second.
Эти тесты показали, что увеличение скорости потока улучшало доставку конъюгированного с флуорофором декстрина с молекулярной массой 3 кДа в клетки для каждого из протестированных чипов. Кроме того, повышение скорости привело к снижению жизнеспособности клеток примерно на 20% в исследуемых устройствах. Такой уровень гибели клеток относительно низок и зачастую оказывается значительно выше в неправильно сконструированных устройствах.
Поглощение декстрина, конъюгированного с красителем Pacific blue, популяцией контрольных клеток, показанной слева, является результатом ограниченного связывания с поверхностью и эффектов эндоцитоза. Клетки подвергались воздействию материала для доставки в течение того же времени, что и обработанные клетки. Справа представлена популяция живых клеток, которые проходили через микрофлюидное устройство при воздействии той же концентрации декстрина, что и контрольные клетки.
Клетки в заштрихованной области считаются недоставленными, а клетки справа от линии определяются как доставленные. При должном навыке и правильном выполнении данная методика занимает менее одного часа. После завершения этой процедуры можно применить другие методы оценки состояния после операции для получения ответов на дополнительные вопросы, такие как эффективность доставки и функциональность материала после его внедрения.
Эта методика открыла исследователям в области регенеративной медицины путь к изучению программирования взрослых первичных клеток с помощью прямой доставки белков. После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как настроить и использовать систему самосжатия для ваших конкретных целей.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данной статье представлен метод безвекторной доставки макромолекул в клетки-мишени посредством быстрого механического деформирования. В протоколе описывается использование микрофлюидного устройства для обеспечения этого процесса.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Клеточная биология
- Микрофлюидика
- Методы внутриклеточной доставки
Введение
- Механическая деструкция представляет собой новый подход к доставке материалов в клетки.
- Этот метод позволяет воздействовать на сложные типы клеток, которые трудно подвергнуть трансфекции.
- Он имеет потенциал применения в терапии рака и манипуляциях с иммунными клетками.
- Для оценки эффективности доставки используется проточная цитометрия.
Цель исследования
- Разработать метод эффективной внутриклеточной доставки макромолекул.
- Улучшить понимание методов перепрограммирования клеток.
- Повысить терапевтическую эффективность иммунных клеток в борьбе с опухолями.
Используемые методы
- Изготовление и стерилизация микрофлюидного устройства.
- Подготовка клеточных суспензий и материалов для доставки.
- Создание избыточного давления в микрофлюидном устройстве для индуцирования деформации клеток.
- Проточный цитометрический анализ для оценки эффективности доставки.
Основные результаты
- Была достигнута успешная доставка макромолекул в целевые клетки.
- Методом проточной цитометрии было подтверждено эффективное внутриклеточное поглощение.
- Метод продемонстрировал преимущества по сравнению с традиционными методами доставки.
- Были отмечены потенциальные возможности применения в терапии рака.
Выводы
- Данный метод механической доставки является перспективной альтернативой для сложных типов клеток.
- Он открывает новые возможности для исследований в области клеточных манипуляций и терапии.
- Необходимы дальнейшие исследования для оптимизации данной методики для различных областей применения.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для промышленности
Внутриклеточная доставка без использования векторов остается критическим узким местом в разработке терапевтических средств, особенно для первичных иммунных клеток и типов клеток, трудно поддающихся трансфекции. Данная микрофлюидная платформа сжатия обеспечивает прямую цитозольную доставку макромолекул и наноматериалов без химической модификации или использования специализированных буферов, что снижает механистическую неопределенность при валидации мишеней. Повышая эффективность доставки в сложных системах, этот метод увеличивает прогностическую достоверность на ранних этапах поиска и снижает риски при трансляционном переходе к применению в иммунотерапии и регенеративной медицине.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранний поиск и валидация мишени
- Научная ценность: обеспечивает возможность функциональной проверки терапевтических гипотез в первичных иммунных клетках и моделях перепрограммирования.
- Операционная ценность: предоставляет воспроизводимую систему без использования буфера для доставки транскрипционных факторов, антител или нуклеиновых кислот с целью оценки связывания с мишенью.
- Прогностическая ценность: помогает в принятии решений о целесообразности дальнейших исследований (go/no-go), подтверждая внутриклеточную доставку эффекторных молекул перед проведением функциональных тестов.
Скрининг и разработка анализа
- Научная ценность: позволяет получать количественные данные об эффективности доставки для различных типов клеток и концентраций материалов с помощью проточной цитометрии.
- Практическая ценность: стандартизирует подготовку образцов за счет контроля скорости сдвига и геометрии устройства, что сводит к минимуму вариабельность при высокопроизводительном скрининге.
- Готовность анализа: предоставляет показатели процента доставки и жизнеспособности, что позволяет ранжировать соединения или материалы в рабочих процессах по идентификации ведущих кандидатов.
Трансляционные и доклинические исследования
- Трансляционная преемственность: обеспечивает переход от модуляции иммунных клеток на этапе фундаментальных исследований к доклинической оценке повышенной противоопухолевой эффективности.
- Снижение механистических рисков: подтверждает доставку иммуномодулирующих белков в цитозоль, снижая зависимость от эндогенных систем экспрессии.
- Системы, релевантные заболеванию: поддерживает тестирование на первичных Т-клетках, дендритных клетках и стволовых клетках, имеющих значение для иммунотерапии рака и регенеративной медицины.
Интеграция конвейера и рабочего процесса
Данный метод вписывается в континуум от этапа поиска до доклинических исследований, обеспечивая проверку гипотез на ранних стадиях биологических исследований, получение образцов, готовых к анализу для скрининга, и механистическую валидацию перед проведением исследований in vivo.
- Биология открытий: облегчает валидацию мишени путем доставки компонентов CRISPR, малых интерферирующих РНК (siRNA) или антител для подтверждения участия конкретного сигнального пути в иммунной активации или определении судьбы клетки.
- Скрининг: обеспечивает доставку библиотек наноматериалов или пептидов в иммунные клетки для их поглощения и функционального скрининга в стандартизированных условиях сдвига.
- Аналитика: предоставляет данные о проценте эффективности доставки и жизнеспособности клеток, полученные методом проточной цитометрии, в качестве количественных конечных точек для сравнения условий.
- Трансляционные исследования: позволяет проводить доклинические испытания модифицированных иммунных клеток с доставленными нагрузками для оценки активности уничтожения опухолевых клеток в моделях совместного культивирования.
- Корпоративное повторное использование: архитектура платформы позволяет использовать ее для различных типов клеток и полезных нагрузок, требуя лишь оптимизации давления и чипа, что поддерживает масштабируемое внедрение в процессах поиска и разработки методов.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Снижает количество ложноотрицательных результатов при валидации мишеней, обеспечивая доставку в первичные и неделящиеся клетки, где вирусные или липидные методы оказываются неэффективными.
- Операционная ценность: Устраняет необходимость в конъюгации полезной нагрузки, использовании специализированных буферов или производстве вирусов, что упрощает рабочий процесс и снижает стоимость одного условия.
- Стратегическая ценность: Повышает уверенность в иммуномодулирующих кандидатах на ранних стадиях за счет подтверждения внутриклеточной доставки перед проведением ресурсозатратных исследований на животных.
- Влияние на портфель: Позволяет осуществлять приоритезацию биопрепаратов, зависящих от доставки (таких как активаторы цитокинов или терапия факторами транскрипции), с учетом рисков на основе достижимых цитозольных концентраций.
Особенности внедрения
- Требуется опыт работы с микрофлюидными устройствами, подготовки клеточных суспензий и регулирования давления для предотвращения засорения или чрезмерной гибели клеток из-за сдвигового напряжения.
- Зависит от наличия микрофлюидных чипов, регуляторов давления, систем резервуаров и проточного цитометра для считывания данных; совместимо со стандартными рабочими процессами в боксах биологической безопасности.
- Для обеспечения воспроизводимости результатов разными пользователями и в разных центрах необходима стандартизация концентрации клеток (1–10 миллионов/mL), предварительное фильтрование через фильтры 40 µm и время инкубации (≤10 min после доставки).
- Требуется оптимизация давления (например, 70 PSI) и скорости потока для каждого типа клеток и конструкции чипа, чтобы сбалансировать эффективность доставки и жизнеспособность клеток; при оптимизированных условиях потеря жизнеспособности обычно составляет <20%.
- Ограничением является возможный засор из-за агрегатов или клеточного детрита, что требует фильтрования клеток и регулярной замены чипа; эффективность варьируется в зависимости от размера клеток, жесткости мембраны и молекулярной массы доставляемого груза.
