Использование Microfluidics фишки для живых изображений и изучения ответов травм в Дрозофилы Личинки
7 февраля 2014 г.
Личинок дрозофилы являются привлекательным модельной системой для живого изображения из-за их полупрозрачной кожицей и мощных генетики. Этот протокол описывает, как использовать в PDMS устройство однослойный, называемый 'личинка чип "для живого изображения клеточных процессов в нейронах 3-й возрастной стадии личинок дрозофилы.
Общая цель данного эксперимента заключается в неинвазивной иммобилизации личинок дрозофил для получения изображений в реальном времени с использованием модифицированной микрофлюидной камеры. Третья звездчатая личинка располагается в чипе с небольшим количеством масла, чтобы помочь запечатать личинок. Далее чип помещается поверх личинок таким образом, чтобы его тело поместилось внутри камеры.
Чип подключается к шприцу, чтобы можно было подать вакуум. Подвижность личинок становится ограниченной, а структуры в брюшной части животного прижимаются вплотную к покровному листу. С помощью конфокального микроскопа легко визуализируются структуры, такие как детали окончаний аксонов сенсорных нейронов и регенерация сегментарных нервов после индуцированного повреждения нервов.
Другие методы иммобилизации жозефы для визуализации в реальном времени, огромный эфир хлороформа или ISO анестетики. Главное преимущество этой методики заключается в том, что она позволяет избежать огромного количества таких токсинов, которые мешают физиологии животного. А дополнительным преимуществом от отсутствия токсинов является то, что личинка GB безопасна и работает с надежной иммобилизацией позволяет визуализировать быстрые события, такие как более быстрый аксональный транспорт и изменения внутриклеточного кальция.
Одна личинка может быть обездвижена и визуализирована в чипе несколько раз. Это позволяет жить во времени. Визуализация процессов, происходящих в течение 72 часов Начните с получения образца чипа PDMS для опробования этого протокола.
Инструкцию по изготовлению чипа A-P-D-M-S из пресс-формы SU eight можно прочитать в текстовом протоколе с помощью дозирующей иглы 21 калибра. Проделайте отверстие в вакуумном порту чипа PDMS для инвертированного микроскопа. Снимите иглу 23 калибра с ее основания, заблокируйте ступицу с помощью нескольких поворотов.
Затем вставьте кончик иглы в небольшой кусочек полиэтиленовой трубки так, чтобы трубка охватывала не менее миллиметра иглы. С помощью лезвия бритвы отрежьте лишнюю трубку. При этом остается пластиковое кольцо, из которого можно сделать уплотнение.
Вставьте наконечник иглы 23 калибра в отверстие вакуумного порта. Для вертикального микроскопа проделайте второе отверстие сбоку от чипа PDMS с помощью дозирующей иглы 21 калибра. Это отверстие обеспечит доступ к первому отверстию сбоку.
Затем вставьте наконечник иглы 23 калибра и кольцо трубки в боковое отверстие. Поместите кусок двустороннего скотча поверх микросхемы PDMS, чтобы запечатать верхнее отверстие. Прикрепите полиэтиленовую трубку длиной 20 сантиметров между наконечником иглы, вставленным в вакуумный порт чипа, и одним из портов трехходового клапана.
Затем присоедините 20-миллилитровый шприц в один из двух оставшихся портов клапана, оставив последний порт открытым. Очистите микросхему PDMS прозрачной клейкой лентой. Приложите кусок скотча к нижней части чипа.
Убедитесь, что лента соприкасается со всей поверхностью PDMS, а затем снимите ленту. Повторите этот метод очистки три раза. Поскольку чип PDMS является многоразовым, очень важно удалить остатки масла, так как они могут повлиять на адгезию PDM к стеклу
.Личинки третьего возраста переходят из пищи в чашку Петри, содержащую воду. Он должен быть от 3,5 до четырех миллиметров в длину, чтобы правильно прилегать к чипу. Купайте личинок для удаления питательной среды.
Далее играет небольшая капля гало из углерода 700 масла в центр стекла крышки слипом, с помощью щипцов аккуратно подхватываем промытые личинки. Ненадолго положите его на легкую салфетку, чтобы вытереть полотенцем, а затем переместите его в масло на 10 секунд. Капля должна быть достаточно маленькой такой, чтобы трахея личинок не была покрыта.
Затем поместите личинок на чистую стеклянную крышку, ненадолго и переместите ее на другую крышку. Таким образом, удаляем еще немного масла. Обратите внимание на ориентацию личинок, чтобы получить изображение нервного канатика и сегментарных нервов.
Подфюзеляжная сторона должна быть направлена вниз. Легко идентифицируемые трахеальные трубки должны быть направлены вверх. Теперь аккуратно поместите чип PDMS поверх личинок.
Выровняйте личинки по центру микрокамеры. При его задней ориентации в сторону вакуумного порта личинка не должна касаться краев камеры. После выравнивания прижмите чип PDMS к стекольному стеклу крышки, чтобы добиться хорошей герметизации.
Затем еще раз убедитесь, что личинки полностью заключены в микрокамеру. Теперь переключите трехходовой клапан на шприц. Крепко держите узел PDMS и потяните поршень шприца, чтобы впустить от двух до 2,5 миллиметров воздуха, пока не почувствуете сопротивление.
Тем самым создается вакуум. Затем закройте вентиль. Чтобы тщательно поддерживать вакуум, дважды проверьте личинок.
Его тело должно быть обездвижено внутри микрокамеры, а трахея должна быть видна. Остальная часть микросхемы PDMS должна соприкасаться со скользящим скольжением крышки Такая ориентация неправильная. Теперь представьте себе личинок.
Если вы используете вертикальный микроскоп, зафиксируйте верхнюю сторону чипа на предметном столике с помощью двустороннего скотча. Когда визуализация будет завершена, освободите вакуум. Затем отсоедините микросхему PDMS от защитного колпачка.
Личинка должна быть немедленно подвижной с помощью щипцов. Верните личинок в тарелку с виноградным соком для восстановления. Поместите одну личинку под наркозом на агаровую пластину с виноградным соком.
Под стереомикроскопом поверните животное брюшной стороной вверх. Чтобы визуализировать вентральный нервный канатик и сегментарные нервы, убедитесь, что личинка полностью неподвижна. Найдите нервный канатик и слюнные железы.
Важно не повредить эти конструкции. Найдите конец третьего брюшного сегмента. Травма здесь повреждает больше всего нервов и ее легче всего воспроизвести, не убивая животное.
Травма также может проводиться в более задних сегментах с помощью дуэта звезда номер пять, щипцов. Плотно зажмите сегментарные нервы через кутикулу на пять-10 секунд. При правильном выполнении кутикула остается неповрежденной, а стенка тела не прокалывается.
Мастерство потребует практики после того, как травма поместила животное брюшной стороной вниз на большую пластину. Он должен иметь возможность двигать головой и есть. Если травма прошла успешно, то задняя половина личинок будет парализована.
Личиночный чип был использован для визуализации кинезин-опосредованного транспорта синаптических везикул в отдельных периферических аксонах. Энтероградное движение этих везикул измерялось со скоростью около 1,0 микрон в секунду. Скорость ретроградного движения составляла 0,8 микрона в секунду.
Методика иммобилизации использовалась для лазерной микрохирургии с использованием импульсного лазера на УФ-красителе. Уровень кальция наблюдался в конкретных нейронах благодаря генетически закодированному показателю. G camp 3.0: всплеск кальция обнаруживается после сенсорного нейрона.
Дендрит пересечен. Позволяя животному отдыхать между сеансами визуализации, можно наблюдать за клеточными событиями во времени. После дробления аксонов эмерических мотонейронов проксимальная культя аксона претерпела новое прорастание.
Между тем, дистальные аксоны образовывали варикозное расширение вен и фрагментировались в процессе валлеровой дегенерации. Также возможно использование личиночного чипа для отслеживания фотопреобразованных флуоресцентных белков in vivo. Слитый белок DRA с двумя альфа-тубулинами, экспрессируемый в сенсорных нейронах четвертого класса, был фотопреобразован в телах клеток.
В течение двух дней значительное количество фотопреобразованного белка было перемещено к окончаниям аксонов сенсорных нейронов на расстоянии примерно миллиметра от первоначального местоположения в теле клетки. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее понимание того, как использовать чип личинок для визуализации личинок дрозофилы в реальном времени и как провести травму нервного сдавливания. Как только эти методы будут освоены, личинки могут быть размещены на микроскопе всего за несколько минут.
Нервное сдавливание происходит так же быстро. Таким образом, эти процедуры могут быть использованы для крупномасштабных экспериментов, таких как генетические степени. Чип может быть использован для визуализации структур на вентральной стороне личинок дрозофилы.
К ним относятся, помимо прочего, мышцы, синапсы нервно-мышечного соединения, сенсорные нейроны, периферические нервы и вентральный нервный канатик. Эта процедура также может быть использована для проведения визуализации в реальном времени личиночного сердца, слюнных желез и трахеи. Чип личинки, используемый в этом видео, имеет размер от 3,5 до 4 миллиметров в длину.
Для визуализации меньшего или большего размера, животные чипы с меньшей или большей камерой могут быть легко изготовлены. Смотрите дополнительный файл проекта и инструкцию по изготовлению микросхем PDMS. Инструкции по изготовлению микросхем PDMS включены в письменный протокол.
Мы можем выслать вам образец чипа, если вы обратитесь к нам.
Обзор
В данном протоколе описан метод неинвазивной иммобилизации личинок Drosophila для прижизненной визуализации с использованием модифицированной микрофлюидной камеры. Данный метод позволяет наблюдать за клеточными процессами в нейронах, в частности, в контексте аксонального транспорта и регенерации нервов.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейробиология
- Клеточная биология
- Методы прижизненной визуализации
Теоретическая часть
- Личинки Drosophila представляют собой ценную модель для изучения нейронных процессов благодаря своей прозрачности и генетической доступности.
- Визуализация живых объектов позволяет получить представление о динамических клеточных событиях в режиме реального времени.
- Традиционные методы иммобилизации часто предполагают использование вредных анестетиков, которые могут влиять на физиологию.
- Данный протокол направлен на обеспечение более безопасной альтернативы для визуализации без использования токсичных веществ.
Цель исследования
- Разработать неинвазивный метод иммобилизации личинок Drosophila для проведения визуализации.
- Облегчить наблюдение за нейронными структурами и процессами.
- Обеспечить возможность повторной визуализации одной и той же личинки в течение длительного периода времени.
Используемые методы
- Использование микрофлюидного устройства из PDMS для иммобилизации личинок.
- Применение вакуума для ограничения подвижности личинок.
- Визуализация нейронных структур с помощью конфокального микроскопа.
- Подробная подготовка чипа из PDMS и позиционирование личинок для оптимальной визуализации.
Основные результаты
- Успешная иммобилизация личинок без использования токсичных анестетиков.
- Четкая визуализация терминалей аксонов сенсорных нейронов и регенерации сегментарных нервов.
- Возможность проведения таймлапс-визуализации в течение 72 часов.
- Демонстрация кинезин-опосредованного транспорта синаптических везикул.
Выводы
- Модифицированная микрофлюидная камера представляет собой безопасный и эффективный метод прижизненной визуализации личинок Drosophila.
- Данный подход позволяет изучать быстрые нейронные события и процессы восстановления.
- Протокол может быть адаптирован для различных задач визуализации в исследованиях в области нейробиологии.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для отрасли
Неинвазивная иммобилизация модельных организмов позволяет проводить лонгитюдную визуализацию динамических клеточных процессов без фармакологических вмешивающих факторов, что способствует снижению механистических рисков при валидации мишеней. Чип для личинок облегчает проведение многократных сессий визуализации в течение 72 часов, позволяя оценивать аксональный транспорт, ответы на повреждения и регенерацию в физиологически релевантной системе. Такой подход повышает прогностическую достоверность доклинических моделей за счет сохранения нативной биологии при наблюдении за нейрональной динамикой.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранний поиск и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет проверять терапевтические гипотезы посредством прямой визуализации аксонального транспорта и кальциевой сигнализации в нейронах.
- Практическая ценность: способствует функциональной валидации мишеней, обеспечивая возможность повторной визуализации одной и той же личинки для оценки взаимодействия с мишенью и модуляции сигнальных путей с течением времени.
- Прогностическая ценность: обеспечивает количественные показатели транспорта органелл и ответов на повреждение, что повышает уверенность в выборе мишени при нейробиологических исследованиях.
Скрининг и разработка методов анализа
- Готовность анализа: Подготовка валидированных биологических систем для последующего скрининга путем иммобилизации личинок для получения стабильных снимков в высоком разрешении вентральных структур.
- Воспроизводимость: Обеспечение стандартизированной подготовки и герметизации личинок в микрокамерах из PDMS, что снижает вариабельность в анализах при визуализации живых объектов.
- Масштабируемость: Облегчение циклов быстрой иммобилизации и визуализации, что позволяет проводить оценку генетических или фармакологических воздействий со средней пропускной способностью.
Трансляционные и доклинические исследования
- Значимость для изучения заболеваний: Моделирует процессы повреждения и регенерации аксонов, имеющие значение для механизмов нейродегенеративных заболеваний.
- Трансляционная преемственность: Связывает поисковую визуализацию с доклинической валидацией, позволяя проводить исследования валлеровской дегенерации и разрастания аксонов в режиме таймлапс.
- Прогресс с учетом рисков: Обосновывает решения о целесообразности дальнейшего продолжения исследований (go/no-go) путем количественной оценки регенеративного и дегенеративного ответов на раздавливание нерва.
Интеграция конвейера и рабочих процессов
Чип для личинок интегрируется в рабочие процессы раннего поиска лекарств, позволяя проводить визуализацию нейронных процессов в режиме реального времени до этапа идентификации ведущих соединений, что способствует проверке гипотез и уточнению сигнальных путей в моделях на основе Drosophila.
- Фундаментальная биология: Обеспечивает проверку гипотез с помощью прямой визуализации кинезин-опосредованного транспорта везикул и потоков кальция в сенсорных нейронах.
- Скрининг: Обеспечивает готовность к проведению анализа за счет воспроизводимой иммобилизации и близости вентральной стороны к покровному стеклу для стабильной визуализации.
- Аналитика: Позволяет проводить количественное измерение скорости аксонального транспорта (1.0 µm/s антероградно, 0.8 µm/s ретроградно) и детектировать кальциевые спайки с помощью генетически кодируемых индикаторов.
- Трансляционные исследования: Связывает метод с доклиническими работами путем моделирования реакций на повреждение аксонов, включая спрутинг и фрагментацию, в течение длительных временных интервалов.
- Повторное использование в масштабе предприятия: Позиционирует микрофлюидный чип из PDMS как многоразовую платформу для лонгитюдных исследований в рамках нескольких экспериментальных сессий.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Повышает точность прогнозирования, позволяя наблюдать быстрые нейронные события без физиологических нарушений, вызванных анестезией.
- Практическая ценность: Обеспечивает воспроизводимость за счет стандартизированной подготовки чипа, вакуумной иммобилизации и протоколов очистки для предотвращения влияния остатков масла.
- Стратегическая ценность: Повышает эффективность использования ресурсов, позволяя многократно использовать одну и ту же личинку, что сокращает количество животных, необходимых для лонгитюдных исследований.
- Влияние на портфель исследований: Позволяет осуществлять приоритизацию с учетом рисков благодаря количественной визуализации показателей дегенерации и регенерации после повреждения.
Особенности реализации
- Требуется опыт работы с микрофлюидными устройствами, вакуумными системами и конфокальной микроскопией для получения оптимальных изображений.
- Зависит от наличия инструментов для формования PDMS, вакуумных портов на базе шприцев и полиэтиленовых трубок для герметизации и создания гидравлических соединений.
- Необходима межгрупповая стандартизация подготовки личинок, нанесения масла и юстировки камеры для обеспечения стабильной иммобилизации.
- Требуется учитывать особенности адаптации для личинок разных размеров, что предполагает корректировку размеров чипа в зависимости от длины тела (3.5–4 mm для стандартного чипа).
- Включает практические ограничения, такие как необходимость избегать покрытия трахей маслом и обеспечения правильной ориентации вентральной стороны для визуализации нервного ствола.
