ПМГК Наночастицы, образованные одним или двумя-эмульсии с витамином E-TPGS

Общая цель данной процедуры заключается в формировании полимерных наночастиц с регулируемым размером. Это достигается путем первоначального растворения полимера в органическом растворителе с добавлением лекарственного вещества или флуоресцентного инкапсулята. На втором этапе полимер эмульгируют с водной фазой, содержащей эмульгирующий агент, после чего частицам дают затвердеть в большем объеме водной среды по мере испарения растворителя.

Затем частицы промывают, собирают путем центрифугирования и лиофилизируют для длительного хранения. Заключительным этапом является определение размера наночастиц и морфологии их поверхности с помощью сканирующей электронной микроскопии или СЭМ-визуализации. В конечном итоге СЭМ используется для демонстрации того, что размер наночастиц можно контролировать, изменяя концентрацию эмульгатора.

Значение данной методики распространяется на терапию различных заболеваний человека, поскольку частицы могут быть модифицированы для инкапсуляции и доставки широкого спектра терапевтических агентов для обеспечения пролонгированного действия в целевой ткани. Визуальная демонстрация данного метода имеет критическое значение.

Этапы эмульгирования освоить довольно сложно, так как тонкие нюансы процесса формирования эмульсии могут существенно повлиять на свойства полученных частиц. Для начала приготовления наночастиц поместите примерно 100 mg поли(молочной-ко-гликолевой кислоты), также известной как PLGA, в пробирку размером 13×100 mm. Затем с помощью стеклянной серологической пипетки перенесите 1 mL этилацетата в образец, накройте верхнюю часть пробирки алюминиевой фольгой и плотно зафиксируйте фольгу парафильмом.

Плотно оберните парафильмом верхний край флакона и нижний край фольги, чтобы предотвратить испарение растворителя. Отметьте уровень растворителя на пробирке и оставьте полимер растворяться на ночь. На следующий день добавьте дополнительный растворитель, если произошло испарение.

Подготовьте следующее оборудование и материалы в вытяжном шкафу рядом с ультразвуковым прибором. Поместите две маленькие стеклянные пастеровские пипетки с резиновыми грушами в вортекс и подготовьте магнитную мешалку. Кроме того, установите на штатив под ультразвуковым прибором большой стакан с ледяной водой.

Затем добавьте 45 milliliters 0.3%weight per volume vitamin E-T-P-G-S в стеклянный стакан объемом 200 milliliter и установите скорость перемешивания на 360 RPM. После этого добавьте two milliliters 0.3%weight per volume vitamin E-T-P-G-S в стеклянную пробирку размером 13 by 100 millimeter. Чтобы смешать гидрофобные агенты, добавьте инкапсулянт непосредственно в раствор полимера, стараясь не задеть стенки пробирки, и перемешивайте содержимое в вортексе до гомогенного распределения инкапсулянта.

Для гидрофильных агентов эмульгируйте инкапсулируемое вещество с раствором полимера. Добавьте до 50 µL препарата в буфере на поверхность раствора полимера. Подвергните смесь ультразвуковой обработке на льду в течение примерно 10 секунд или до тех пор, пока раствор не станет матовым и гомогенным.

Затем подвергните пробирку с витамином E-T-P-G-S интенсивному перемешиванию на вортексе, удерживая ее вертикально. Держите стеклянную пастеровскую пипетку на расстоянии одного-двух сантиметров над верхним краем перемешиваемой пробирки и медленно добавляйте раствор полимера по каплям на поверхность жидкости в пробирке. Следите за тем, чтобы пипетка не касалась стенок пробирки, пока весь раствор полимера не будет добавлен.

Продолжайте перемешивание раствора на вортексе. Теперь перемешивайте в течение 15 секунд до образования эмульсии. Немедленно перенесите эмульгированный полимер в ультразвуковой гомогенизатор.

Держите пробирку погруженной в ледяную воду и подвергайте эмульсию воздействию ультразвука тремя сериями по десять секунд. Перемещайте зонд вверх и вниз в эмульсии, чтобы обеспечить равномерную соникацию, избегая касания зондом стенок или дна пробирки. Делайте паузы от 5 до 10 секунд между каждым десятисекундным циклом соникации, чтобы раствор успел остыть перед продолжением.

Затем добавьте один-два миллилитра 0,3% vitamin E-T-P-G-S из раствора для перемешивания в эмульсию. Это разжижит эмульгированный полимер, что облегчит сливание; перелейте эмульсию в раствор для перемешивания. Промойте пробирку, сливая остатки раствора в раствор для перемешивания.

Дайте наночастицам затвердеть, перемешивая их в течение трех часов. Если инкапсулирующее вещество чувствительно к свету, оберните стакан алюминиевой фольгой, оставив верхнюю часть открытой для облегчения испарения растворителя. Чтобы собрать наночастицы, разделите их поровну в две центрифужные пробирки Oak Ridge номинальным объемом 30 мл и сбалансируйте их с точностью до 0.1 г. Затем центрифугируйте наночастицы в роторе с фиксированным углом в течение 15 минут при 17 000.

RC f. Более длительное центрифугирование позволит собрать большую фракцию более мелких наночастиц. Удалите супернатант, стараясь не задеть осадок наночастиц.

Добавьте 5 мл дистиллированной воды и используйте водяную баню, ротатор и вортекс для полного суспендирования наночастиц. Объедините содержимое двух центрифужных пробирок в одну и добавьте 20 мл дистиллированной воды, чтобы общий объем составил 30 мл. Затем повторите этапы центрифугирования и промывки еще дважды, чтобы в сумме получилось три промывки.

Объем жидкости в последней суспензии ресуспендированного осадка должен составлять от четырех до пяти миллилитров. Заморозьте небольшую аликвоту наночастиц без TLO для СЭМ-визуализации, а остальную часть оставьте. Добавьте TLO в весовом соотношении от одного к двум по отношению к полимеру в качестве криопротектора для равномерной и полной ресуспензии наночастиц PLGA.

Это предотвратит образование кристаллов льда, которые могут повредить поверхность частиц и вызвать агрегацию. Перенесите наночастицы в предварительно взвешенную центрифужную пробирку объемом 5 мл, затем заморозьте при температуре -80 °C минимум на 30 минут. После этого снимите крышку с пробирки и прикройте ее сверху, закрепив лабораторную салфетку с помощью резинки.

Действуйте быстро, чтобы содержимое не растаяло, если начнется процесс плавления. Повторно заморозьте образец перед помещением в лиофилизатор, затем лиофилизируйте образец объемом 5 мл в течение 72 часов. После этого закройте пробирку крышкой, оберните её и храните лиофилизированные частицы при температуре -80 °C.

В день проведения визуализации нанесите полоску двусторонней углеродной ленты на держатель образца для СЭМ. Подпишите металлическую часть держателя перманентным маркером для последующей идентификации. С помощью металлического шпателя возьмите небольшое количество лиофилизированных наночастиц и аккуратно распределите их по поверхности ленты.

Протрите поверхность держателя лабораторной салфеткой или используйте сжатый воздух для удаления несвязанных наночастиц. Визуализацию частиц проводите при рабочем расстоянии пучка от 5 до 15 мм, ускоряющем напряжении от 5 до 12 кВ и размере пятна от 1 до 3; более высокая энергия пучка может привести к локальному нагреву образца, что изменит морфологию поверхности частиц. Микрочастицы наблюдают при 100-кратном увеличении, а наночастицы становятся различимы при 3000-кратном.

Сфокусируйте увеличение на верхней части сферы, чтобы обнаружить частицы, которые легко визуализируются с помощью СЭМ; сделайте как минимум три снимка каждой партии для получения репрезентативной выборки по размеру и морфологии частиц. С помощью данного метода могут быть созданы частицы путем одиночной эмульсии, которые выглядят как отдельные несплавленные сферы с гладкой морфологией поверхности и широким диапазоном размеров, распределенных по всему образцу. Показанные здесь микрочастицы имеют средний диаметр 730 nanometers.

Здесь представлены наночастицы, созданные методом однократной эмульсии, которые инкапсулируют гидрофобный препарат кампин. Полученные частицы оказались еще меньше, с средним диаметром 340 nanometers. Более высокие концентрации эмульгатора приводили к образованию более мелких частиц, средний диаметр которых уменьшался с 2000 до 200 nanometers.

По мере увеличения концентрации эмульгатора от 0,01 до 0,3%, как показано на данных СЭМ-изображениях. Однако при слишком высокой концентрации vitamin E-T-P-G-S дискретные частицы не образовывались; при использовании 1% vitamin E-T-P-G-S во всей структуре наблюдались сильное слияние и листоподобные образования. Верно. После того как вы освоите метод получения наночастиц PLG путем эмульгирования, можно применить другие методы, такие как модификация поверхности, чтобы адаптировать наночастицы для взаимодействия со специфическими типами клеток или определенными областями организма.

После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как формировать частицы с воспроизводимым и регулируемым размером методом эмульгирования.