Изоляция и характеристика химерных человеческих fc-выражать протеины используя протеин Адсорберы мембраны и обтекаемый рабочий процесс

Общая цель данной процедуры заключается в эффективном и результативном выделении и характеристике химерных белков человека, экспрессирующих FC, с использованием мембранных абсорберов с протеином А и оптимизированного рабочего процесса. Это достигается путем предварительного осветления супернатанта клеточной культуры с помощью фильтра с порами 0,22 micron. На втором этапе осуществляется сбор системы потока и начало перфузии супернатанта клеточной культуры через мембранный абсорбер с протеином А.

Затем белок, экспрессирующий человеческий FC, элюируют с мембранного абсорбента, после чего полученный EIT концентрируют с помощью ультрафильтрации с последующей сменой буфера путем диализа. На заключительном этапе используют проточную цитометрию и вестерн-блоттинг для определения качества и количества концентрированного белка. В конечном итоге применение мембранных абсорбентов с белком А в сочетании с оптимизированным рабочим процессом демонстрирует сокращение времени обработки и потенциальное увеличение выхода белка по сравнению с традиционной аффинной хроматографией с использованием колонок Protein A aro speed.

Таким образом, основным преимуществом данной методики перед существующими методами, такими как колоночная аффинная хроматография, является то, что мембранный абсорбер позволяет потенциально увеличить выход белка при сокращении времени обработки. Подбор соответствующих методов характеризации также может сократить время обработки. Подготовьте мембранный абсорбер в соответствии с инструкциями производителя, убедившись, что все используемые растворы имеют комнатную температуру и предварительно профильтрованы через фильтр 0,22 мкм. Для начала наполните шприц объемом 10 мл профильтрованным (0,22 мкм) фосфатно-солевым буфером (PBS) или DPBS и удалите все пузырьки воздуха.

Чтобы воздух не попал в мембранный абсорбер, перед использованием промойте его раствором DPBS для удаления консервирующего раствора и уравновешивания мембраны. Непосредственно перед подачей через мембранный абсорбер профильтруйте супернатант клеточной культуры, используя стерильный фильтрующий блок с порами 0,22 мкм, чтобы подготовить мембранный абсорбер с белком A; наберите супернатант клеточной культуры в шприц с системой Luer-Lock и удалите все пузырьки воздуха для подготовки материалов и оборудования. Сначала подсоедините шприц к входному отверстию мембранного абсорбера.

При желании подсоедините гибкий шланг к выходу мембранного абсорбера. Установите шприцевой фильтр 0.22 micron между шприцем и мембранным абсорбером. Используйте колбу или бутыль для сбора жидкости из абсорбера.

Установите на шприцевом насосе требуемую скорость объемного потока, не превышая значения, рекомендованного производителем. Пропустите супернатант клеточной культуры через мембранный абсорбер, собирая фильтрат. При необходимости повторно заполняйте шприц супернатантом.

При желании проверьте проточное содержимое на наличие белка с помощью проточной цитометрии, вестерн-блоттинга или ИФА, в зависимости от предпочтений лаборатории; обычно повторная перфузия проточного содержимого для элюции белка из мембранного абсорбера не требуется. Сначала промойте мембранный абсорбер 10 milliliters DPBS, чтобы удалить любой несвязанный белок. Элюируйте белок из мембранного абсорбера с заданной скоростью потока.

Используйте от 10 до 15 миллилитров элюирующего буфера. Соберите EIT в пробирку, содержащую нейтрализующий буфер в объеме 10% от объема элюата. После элюции белка регенерируйте мембранный абсорбент в соответствии с инструкциями производителя.

Заполните мембранный абсорбер 20% раствором этанола в DPBS для длительного хранения при температуре четырех градусов Цельсия. Осадите весь EIT в центрифужном фильтрующем устройстве с пределом отсечения по молекулярной массе 10 килДальтон.

Следуйте инструкциям производителя по центрифужному диализу. Ретентат в малообъемном диализном модуле с пределом отсечения по молекулярной массе 10 кДа диализируют против выбранного буфера; в диализированный материал может потребоваться добавление буфера.

Если существует вероятность преципитации белка, проведите разделение очищенного белка и стандартов FC на выбранном геле методом SDS-PAGE в восстанавливающих или невосстанавливающих условиях по своему усмотрению. Для минимизации времени анализа используйте мини-гель; нанесите несколько вариантов количества очищенного белка, включая образцы, разведенные DPBS, чтобы убедиться, что сигналы полос очищенного белка находятся в линейном диапазоне сигналов стандартов FC. Для анализа изображений после разделения на геле перенесите белки с геля на поливинилифтордиową мембрану в разрывной буферной системе с помощью полусухого блоттера согласно инструкциям производителя; время переноса обычно составляет от 5 до 10 минут.

После переноса гель окрашивают кумасси для проверки эффективности переноса. Выполняют иммуноблоттинг с использованием антител к FC или IgG, конъюгированных с щелочной фосфатазой или пероксидазой хрена, с применением системы вакуумного детектирования белков. Время проведения иммуноблоттинга обычно составляет менее одного часа.

Проведите проявку иммуноблоттинга с использованием выбранного субстрата и метода. Определите количество очищенного белка с помощью анализа изображений. Выполните линейную регрессию сигналов полос стандартных образцов FC.

Если коэффициент детерминации R² превышает 0,90, используйте уравнение прямой для расчета количества белка по сигналу его полосы, при необходимости учитывая разбавление образца. Поскольку количественное определение белка проводится на основе fc, скорректируйте значение с учетом разницы в молекулярной массе между белком и fc. Если R² меньше 0,90, повторите процедуру экспресс-вестерн-блоттинга.

Наконец, подтвердите свойства белка с помощью функциональных анализов или методов детектирования FC с использованием проточной цитометрии. Для проверки наличия функционального GAL one HFC в исходном супернатанте клеточной культуры использовали вестерн-блоттинг или проточную цитометрию EISA; свежая среда для культивирования клеток, показанная здесь красным цветом, служила отрицательным контролем (синяя гистограмма). Накладывающаяся на нее зеленая гистограмма представляет собой профиль несвязанной фракции (flow-through), что указывает на эффективный захват и удержание GAL one HFC мембранным абсорбентом. Элюирование GAL one HFC с мембранного абсорбента проводили порциями по 1 mL со скоростью 1 mL/min, используя кислый буфер на основе амина; затем нейтрализованные элюаты тестировали на наличие функционального GG one HFC методом проточной цитометрии. Сигнал GL one HFC последовательно возрастал от элюата 1, примерно равного отрицательному контролю, до максимума в элюате 3, а затем снижался до почти постоянного уровня в элюатах 9 и 10.

Конечный EEU 10 не достиг эквивалентности сигналу отрицательного контроля из-за частичного удержания адсорбентом GL one HFC; количественное определение и характеристика очищенного GL one HFC были проведены с помощью процедуры вестерн-блоттинга, ускоренной за счет полусухого переноса и иммуноблоттинга с вакуумной поддержкой. Путем сравнения сигнала GA one HFC со стандартами количественного определения HFC были определены как количество, так и качество очищенного материала.

Сигналы GAL one HFC и деградированного GAL one HFC находились в пределах стандартного диапазона. Интенсивность сигналов стандартных полос HFC была линейно связана с количеством присутствующего HFC. Концентрация очищенного GAL one HFC на основе HFC, определенная с помощью обработки изображений, составила 450 micrograms per milliliter.

Корректировка с учетом молекулярной массы G1HFC. Концентрация очищенного материала составляла 720 µg/mL. Напротив, в дорожки шесть и семь представленного здесь вестерн-блоттинга было нанесено слишком большое количество очищенного GAL1HFC, что привело к сигналам, которые насытили или превысили диапазон стандартов HFC, тем самым сделав количественный анализ невозможным.

В качестве альтернативы вестерн-блоттингу для экспресс-контроля качества и/или количественного анализа может использоваться окрашивание гелей кумаси. Обратите внимание, что в образце деградированного GAL one HFC, помимо полос примерно 25 kilodaltons и 40 kilodaltons, присутствовала полоса примерно 10 kilodaltons. Эта полоса представляет собой деградированный GAL one HFC, который не прореагировал с антителом для детекции, использовавшимся при вестерн-блоттинге.

После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как выделять химерные белки человека, экспрессирующие FC, с использованием мембранных абсорберов, и как охарактеризовать эти белки всего за четыре часа.