Содержание C. elegans

Правильный уход и содержание Caenorhabditis elegans имеют решающее значение для успешного проведения экспериментов.

Они занимают очень мало места, недороги в содержании, обладают высокой плодовитостью и легко поддаются манипуляциям. Однако простота содержания не означает примитивности научных исследований. На самом деле, Сидней Бреннер назвал C. elegans "даром природы науке," и с момента внедрения этого организма в практику в 1974 году нематоды стали объектом ряда экспериментов, отмеченных Нобелевской премией.

В данном видео мы продемонстрируем основные методы содержания C. elegans в лаборатории, включая: размещение и кормление, манипуляции с особями, а также замораживание и размораживание червей.

В естественной среде C. elegans обитают в почве и питаются разлагающимися растительными остатками. В лаборатории важно создать для нематод максимально подходящие условия, поэтому мы используем строго определенные методы их содержания и кормления.

C. elegans могут выращиваться при 16, 20 или 25 °C в зависимости от требований эксперимента, как на твердых, так и в жидких средах. В обоих случаях их кормят OP50 — стандартизированным штаммом E. coli, который используется специально для культивирования нематод в каждой лаборатории по работе с червями по всему миру.

При выращивании при 25 °C C. elegans завершают свой жизненный цикл в 2,1 раза быстрее, чем при 16 °C. Более быстрый жизненный цикл означает, что черви быстрее созревают, откладывают больше яиц и потребляют больше пищи. Если черви голодают или их становится слишком много в ограниченном пространстве, они переходят в личиночную стадию, называемую стадией dauer. Личинки dauer устойчивы к стрессу и не стареют.

При содержании на твердых средах C. elegans выращивают на агарных чашках, приготовленных на среде для роста нематод или среде NGM. За день до приготовления чашек инокулируйте жидкую среду LB одной колонией E. coli OP50. Инкубируйте среду при 37 °C в течение ночи при перемешивании.

Для приготовления твердой среды отмерьте и смешайте соответствующие количества этих ингредиентов с деионизированной водой в колбе Эрленмейера.

После автоклавирования в течение не менее 15 минут дайте агару остыть до 55 °C на водяной бане. Когда среда остынет до 55 °C, вы сможете комфортно держать стеклянный контейнер голыми руками. Используя надлежащую технику асептики, в это время можно добавить такие добавки, как лекарственные препараты или антибиотики. Перемешайте круговыми движениями. Затем с помощью пипетки разлейте расплавленный NGM в чашки Петри, пока они не будут заполнены на 2/3. Оставьте свежеприготовленные чашки высыхать на столе на ночь.

На следующее утро осадите OP50 центрифугированием при 3500 x g в течение 10 минут, а затем ресуспендируйте бактерии в среде LB до 10-кратной концентрации. Теперь нанесите пипеткой центральный газон на каждую чашку. Избегайте касания наконечником пипетки поверхности NGM и следите за тем, чтобы культура не касалась стенок чашки. Оставьте чашки высыхать на столе на ночь. После высыхания подвергните чашки воздействию УФ-излучения для их стерилизации. Теперь они готовы к использованию при культивировании червей.

C. elegans перемещают по отдельности с помощью инструмента, называемого «червячной иглой» (worm pick). Обычно такая игла изготавливается из проволоки диаметром 30 gauge, состоящей из 90% платины и 10% иридия, хотя некоторые исследователи могут предпочитать немного другой состав металла. Чтобы изготовить иглу, начните с того, что отломите кончик пипетки Пастера до нужной длины.

Отрежьте около 3–4 cm проволоки и вставьте 0,5 cm ее длины в кончик пипетки. Приплавьте проволоку к стеклу на горелке Бунзена. Длина проволоки, выступающей из стекла, составляет примерно 3–3,5 cm, но может варьироваться в зависимости от индивидуальных предпочтений.

Расплющите конец проволоки, используя твердый край. Затем отогните расплющенную часть вверх, чтобы сформировать зачерпывающий изгиб. В завершение зашлифуйте края иглы, чтобы избежать повреждения червя или агара.

Для захвата червей простерилизуйте проволоку иглы в пламени. Затем покройте кончик густой, липкой культурой E. coli штамма OP50 с чашки с NGM-средой. Будьте осторожны, чтобы не проколоть и не поцарапать поверхность агара.

Глядя в диссекционный микроскоп, осторожно подцепите червя расплющенным липким концом иглы, пока червь не прилипнет к ней.

Как только червь окажется на игле, немедленно перенесите его, слегка прижав кончик к поверхности новой чашки и переместив его по бактериальному газону. Червь должен самостоятельно сползти с иглы. Не держите червя на игле слишком долго, иначе он может высохнуть.

Одна из причин, по которой C. elegans является популярной моделью для исследований, заключается в том, что культуры могут храниться в течение длительного времени без каких-либо негативных последствий.

Сначала промойте недавно подвергнутых голоданию личинок, используя 0,5 ml буфера M9; осторожно перемешайте содержимое круговыми движениями, чтобы отделить всех личинок и взрослых особей, а затем перенесите их в микроцентрифужную или криопробирку. Затем добавьте равный объем 30% глицерина в буфере M9. В завершение поместите пробирку в термоизолированный контейнер и храните при -80 °C.

Для восстановления червей извлеките пробирку из морозильника с температурой -80 °C и дайте ей оттаять при комнатной температуре до полного разжижения содержимого. Перенесите жидкость пипеткой на свежую чашку с NGM и газоном OP50 и инкубируйте при 20 °C. Через 2-3 дня перенесите 10-15 особей на новую чашку и дайте им размножиться в течение одного поколения. Соберите потомство и оцените наличие правильных фенотипов.

Теперь, когда мы увидели, как поддерживают популяцию C. elegans в лаборатории, давайте рассмотрим, как условия кормления, содержания и манипуляций модифицируются для проведения экспериментов.

Нобелевское открытие РНК-интерференции позволило исследователям «выключать» любой ген C. elegans для определения его функции.

Мы можем индуцировать РНК-интерференцию у C. elegans, предварительно подготовив чашки с E. coli, которые экспрессируют двухцепочечную РНК (дцРНК) целевого гена, которой будут питаться черви.

Затем червей на 4-й личиночной стадии переносят на чашки с РНК-интерференцией и оставляют для откладки яиц. На нужной стадии развития потомство собирают и анализируют на наличие фенотипов. Поскольку мы разделяем около половины своего генома с этим червем, многие полученные данные применимы к заболеваниям человека.

Благодаря быстрому жизненному циклу C. elegans особенно хорошо подходит в качестве модели старения.

Сначала создается синхронизированная по времени популяция C. elegans путем откладки яиц взрослыми гермафродитами на чашки с NGM. Черви откладывают яйца в течение 6-8 hr, после чего их удаляют.

Когда черви достигают нужной стадии, их переносят на новые чашки с NGM, содержащие ампициллин для предотвращения бактериального загрязнения и FUDR для предотвращения размножения.

С этого момента за взрослыми червями наблюдают каждые 2-3 дня, пока все черви не погибнут. Мертвых червей удаляют с чашки, а количество живых и мертвых червей фиксируют.

Анализ продолжительности жизни в контексте генетических или средовых воздействий может дать значительное понимание процессов старения.

С помощью лазеров можно выполнять аксотомию, то есть перерезание отдельных аксонов, у живых C. elegans для изучения регенерации нервных клеток.

Однако, поскольку черви постоянно двигаются, их помещают на 10% агарозные подушечки в растворе микросфер. Сверху накрывают покровным стеклом. Микросферы увеличивают коэффициент трения при взаимодействии подушечки и покровного стекла, фактически фиксируя червя на месте.

Теперь препарат готов к проведению аксотомии. Нейроны находят и центрируют в поле зрения микроскопа. Затем с помощью ножной педали активируют лазер. Оптимальная мощность лазера позволяет перерезать нейрон, не повреждая соседние структуры. У каждого животного перерезают как можно больше аксонов.

Затем агарозную подушечку осторожно снимают со стекла, и червям дают восстановиться на засеянной чашке с NGM при 20 °C. Через 8-48 hr после аксотомии нейроны подготавливают для оценки регенерации. В дистальной части разреза нейрон формирует культю. Однако в проксимальной части нейрон регенерирует, образуя удлиненные нейриты.

Вы только что посмотрели видео JoVE, посвященное основам содержания Ceanorhabditis elegans. В этом видео мы рассмотрели: условия содержания и кормление C. elegans, правила работы с ними, а также заморозку и восстановление нематод.

Мы также кратко ознакомились с некоторыми областями применения, которые делают C. elegans таким мощным инструментом исследований. Несмотря на то, что C. elegans во многих отношениях отличаются от млекопитающих, их схожий генетический состав, простота в содержании и легкость манипуляций делают их важной моделью в стремлении понять биологию и заболевания млекопитающих. Спасибо за просмотр!