РНК-интерференция у C. elegans
РНК-интерференция, или RNAi, представляет собой широко используемый метод, при котором в организм вводят двухцепочечную РНК, что приводит к направленному сайленсингу генов. Нобелевское открытие РНК-интерференции позволило исследователям подавлять экспрессию любого гена C. elegans для определения его функции. Мы можем индуцировать RNAi у C. elegans, предварительно подготовив чашки с E. coli, экспрессирующими дцРНК целевого гена, которой будут питаться черви. Затем червей на 4-й личиночной стадии переносят на чашки с RNAi и оставляют для откладки яиц. На нужной стадии развития потомство собирают и анализируют на наличие фенотипических признаков.
Технология RNAi часто применяется у C. elegans для проведения обратного генетического скрининга, автоматизированного высокопроизводительного скрининга, а также в качестве инструмента изучения процессов развития. В этом видео мы объясним концепцию РНК-интерференции, продемонстрируем применение метода RNAi у <. elegans> и обсудим, как ученые используют RNAi для более глубокого понимания распространенных биологических процессов.
Для начала разберем принцип работы РНК-интерференции. В случае с C. elegans червям скармливают бактерии, трансформированные плазмидами, которые кодируют двухцепочечную РНК, комплементарную гену, который необходимо заблокировать. Как упоминалось ранее, C. elegans питаются трансформированными бактериями. После проглатывания dsRNA проникает в ткани C. elegans посредством пока неизвестного механизма.
Оказавшись внутри клетки, фермент Dicer расщепляет двухцепочечную РНК на короткие интерферирующие РНК (siRNA) длиной от 21 до 23 нуклеотидов. Затем siRNA связывается с РНК-индуцированным silencing-комплексом, также известным как "RISC", и раскручивается. После этого комплекс siRNA/RISC связывается с целевой мРНК посредством комплементарного спаривания оснований. Это приводит к деградации мРНК, тем самым вызывая нокдаун данного гена.
Перед началом процедуры необходимо подготовить бактерии, экспрессирующие интересующую двухцепочечную РНК. В коммерческой продаже доступны библиотеки бактерий, содержащих плазмиды, кодирующие дцРНК для тысяч генов. В противном случае последовательность целевого гена необходимо клонировать в плазмиду с использованием стандартных методов клонирования. Плазмида содержит ген устойчивости к антибиотику ампициллину, который можно использовать для селекции бактериальных колоний, содержащих плазмиду.
Затем с помощью стандартных методов трансформируйте плазмиду, кодирующую интересующую вас дцРНК, в штамм E. coli (DE3), который будет экспрессировать двухцепочечную РНК. Также трансформируйте бактерии пустой плазмидой в качестве контроля. Важно отметить, что штамм E. coli, используемый в этих экспериментах, лишен РНК-полимеразы III, которая в противном случае расщепляла бы двухцепочечную РНК. Эти бактерии также содержат индуцибельный IPTG ген Т7-ДНК-полимеразы, которая транскрибирует дцРНК в плазмиде. Наконец, бактерии (DE3) устойчивы как к тетрациклину, так и к карбенициллину для поддержания экспрессии РНК-полимеразы III и предотвращения нежелательного роста бактерий.
Высейте трансформированные бактерии HT115(DE3) на чашки с LB-агаром, содержащим 12.5 μg/ml тетрациклина и 25 μg/ml карбенициллина. Инкубируйте в течение ночи при 37 °C; на следующее утро на чашках появятся бактериальные колонии. Затем выберите одну бактериальную колонию и перенесите ее в 1 ml LB-бульона, содержащего 100 μg/ml ампициллина, для селекции бактерий, содержащих плазмиду. Инкубируйте в течение ночи при 37 °C с перемешиванием. После ночной инкубации добавьте в культуру 5 ml LB-бульона, содержащего 100 μg/ml ампициллина, и инкубируйте еще 4-6 часов при 37 °C.
После подготовки бактерий необходимо изготовить чашки с РНК-интерференционными (RNAi) средами для кормления. Чашки для RNAi содержат: агар, воду, карбенициллин, питательную смесь для червей (Worm medium mix) и IPTG для индукции Т7-ДНК-полимеразы в бактериях, которая транскрибирует дцРНК из плазмиды. Добавьте 0,5 ml бактериальной культуры в чашки для RNAi и инкубируйте в течение ночи при 37 °C для создания бактериального газона.
Перед переносом червей на RNAi-чашки важно синхронизировать стадию их развития, чтобы любые наблюдаемые различия в фенотипе не были артефактом стадии развития. Для синхронизации стадий развития сначала простерилизуйте платиновую петлю в пламени горелки.
С помощью петли перенесите червей стадии L4 на каждую RNAi-чашку и инкубируйте в течение ночи при 20 °C, чтобы они перешли в стадию молодых взрослых особей, откладывающих яйца. Затем перенесите молодых взрослых особей на новую RNAi-чашку и инкубируйте в течение 6-8 часов при 20 °C, в течение которых происходит откладка яиц. После удаления всех взрослых особей эти яйца будут синхронизированы по развитию. Наконец, дайте червям вырасти на RNAi-чашках до достижения стадии развития, интересующей для анализа.
Для визуализации червей необходимо подготовить предметное стекло с 4% агаровой подушечкой. Сначала закрепите две предметные пластины маркировочной лентой, создав проставки, которые обеспечат равномерную толщину агарового слоя. Поместите чистое предметное стекло между двумя проставками и пипеткой нанесите на него около 150 μl расплавленного 4% агара. Быстро накройте расплавленный агар другим стеклом перпендикулярно проставкам. Осторожно разделите стекла, после чего агаровая подушечка останется прилипшей к одному из них.
Затем добавьте на агаровую подушечку 10 μl анестетика, например азида натрия, чтобы иммобилизовать животных. С помощью платиновой иглы перенесите червей на агаровую подушечку с анестетиком и накройте покровным стеклом. В завершение исследуйте червей под микроскопом. Сравните червей с нокдауном генов путем РНК-интерференции с контрольной группой и отметьте различия в размере, стадии развития, морфологии, паттернах локализации флуоресцентно меченных белков и других потенциальных фенотипах.
Одним из наиболее ценных применений РНК-интерференции является возможность легко проводить скрининги обратной генетики. Скрининг обратной генетики — это подход к изучению функции гена путем нокдауна известной совокупности генов и оценки полученного фенотипического результата. Например, исследователи могут использовать библиотеку бактерий, экспрессирующих дцРНК почти для всех генов генома C. elegans. Эти бактерии культивируют в многолуночных планшетах и скармливают червям. Затем оценивают фенотипические эффекты РНК-интерференционного нокдауна множества генов, что позволяет получить представление о нормальных функциях генов in vivo.
Автоматизированные генетические скрининги представляют собой тип скрининга обратной генетики с чрезвычайно высокой пропускной способностью. При автоматизированных генетических скринингах можно очень легко осуществить нокдаун всего генома C. elegans, используя роботизированную обработку тысяч бактериальных клонов и специализированные приборы для количественного анализа.
Например, черви, экспрессирующие трансгенный флуоресцентный репортер гена антимикробного пептида nlp 29, подвергаются РНК-интерференционному нокдауну тысяч генов посредством скармливания бактерий. Одновременно червей подвергают воздействию спор грибов. После этого оценивают ответ антимикробного пептида на грибковую инфекцию.
Развитие C. elegans часто изучают с помощью РНК-интерференции. Ученые могут использовать РНК-интерференцию для нокдауна любого интересующего гена (или группы генов) и точно оценить, как этот ген влияет на процессы в ходе развития и/или на сроки развития. Например, нокдаун с помощью РНК-интерференции может выявить гены, подавление которых замедляет развитие, или гены, участвующие в развитии органов.
Вы только что посмотрели вводное видео JoVE по РНК-интерференции у C. elegans. Мы рассмотрели механизм работы РНК-интерференции и способы ее применения у C. elegans путем скармливания бактерий. РНК-интерференция является ценным инструментом для обратного генетического скрининга, включая автоматизированный высокопроизводительный скрининг, а также полезным методом изучения развития. Спасибо за просмотр!
РНК-интерференция (РНКи) — это широко используемый метод, при котором в организм экзогенно вводят двухцепочечную РНК, что вызывает нокдаун целевого ге…
РНК-интерференция, или RNAi, представляет собой широко используемый метод, при котором в организм вводят двухцепочечную РНК, что приводит к направленному сайленсингу генов. Нобелевское открытие РНК-интерференции позволило исследователям подавлять экспрессию любого гена C. elegans для определения его функции. Мы можем индуцировать RNAi у C. elegans, предварительно подготовив чашки с E. coli, экспрессирующими дцРНК целевого гена, которой будут питаться черви. Затем червей на 4-й личиночной стадии переносят на чашки с RNAi и оставляют для откладки яиц. На нужной стадии развития потомство собирают и анализируют на наличие фенотипических признаков.
Технология RNAi часто применяется у C. elegans для проведения обратного генетического скрининга, автоматизированного высокопроизводительного скрининга, а также в качестве инструмента изучения процессов развития. В этом видео мы объясним концепцию РНК-интерференции, продемонстрируем применение метода RNAi у <. elegans> и обсудим, как ученые используют RNAi для более глубокого понимания распространенных биологических процессов.
Для начала разберем принцип работы РНК-интерференции. В случае с C. elegans червям скармливают бактерии, трансформированные плазмидами, которые кодируют двухцепочечную РНК, комплементарную гену, который необходимо заблокировать. Как упоминалось ранее, C. elegans питаются трансформированными бактериями. После проглатывания dsRNA проникает в ткани C. elegans посредством пока неизвестного механизма.
Оказавшись внутри клетки, фермент Dicer расщепляет двухцепочечную РНК на короткие интерферирующие РНК (siRNA) длиной от 21 до 23 нуклеотидов. Затем siRNA связывается с РНК-индуцированным silencing-комплексом, также известным как "RISC", и раскручивается. После этого комплекс siRNA/RISC связывается с целевой мРНК посредством комплементарного спаривания оснований. Это приводит к деградации мРНК, тем самым вызывая нокдаун данного гена.
Перед началом процедуры необходимо подготовить бактерии, экспрессирующие интересующую двухцепочечную РНК. В коммерческой продаже доступны библиотеки бактерий, содержащих плазмиды, кодирующие дцРНК для тысяч генов. В противном случае последовательность целевого гена необходимо клонировать в плазмиду с использованием стандартных методов клонирования. Плазмида содержит ген устойчивости к антибиотику ампициллину, который можно использовать для селекции бактериальных колоний, содержащих плазмиду.
Затем с помощью стандартных методов трансформируйте плазмиду, кодирующую интересующую вас дцРНК, в штамм E. coli (DE3), который будет экспрессировать двухцепочечную РНК. Также трансформируйте бактерии пустой плазмидой в качестве контроля. Важно отметить, что штамм E. coli, используемый в этих экспериментах, лишен РНК-полимеразы III, которая в противном случае расщепляла бы двухцепочечную РНК. Эти бактерии также содержат индуцибельный IPTG ген Т7-ДНК-полимеразы, которая транскрибирует дцРНК в плазмиде. Наконец, бактерии (DE3) устойчивы как к тетрациклину, так и к карбенициллину для поддержания экспрессии РНК-полимеразы III и предотвращения нежелательного роста бактерий.
Высейте трансформированные бактерии HT115(DE3) на чашки с LB-агаром, содержащим 12.5 μg/ml тетрациклина и 25 μg/ml карбенициллина. Инкубируйте в течение ночи при 37 °C; на следующее утро на чашках появятся бактериальные колонии. Затем выберите одну бактериальную колонию и перенесите ее в 1 ml LB-бульона, содержащего 100 μg/ml ампициллина, для селекции бактерий, содержащих плазмиду. Инкубируйте в течение ночи при 37 °C с перемешиванием. После ночной инкубации добавьте в культуру 5 ml LB-бульона, содержащего 100 μg/ml ампициллина, и инкубируйте еще 4-6 часов при 37 °C.
После подготовки бактерий необходимо изготовить чашки с РНК-интерференционными (RNAi) средами для кормления. Чашки для RNAi содержат: агар, воду, карбенициллин, питательную смесь для червей (Worm medium mix) и IPTG для индукции Т7-ДНК-полимеразы в бактериях, которая транскрибирует дцРНК из плазмиды. Добавьте 0,5 ml бактериальной культуры в чашки для RNAi и инкубируйте в течение ночи при 37 °C для создания бактериального газона.
Перед переносом червей на RNAi-чашки важно синхронизировать стадию их развития, чтобы любые наблюдаемые различия в фенотипе не были артефактом стадии развития. Для синхронизации стадий развития сначала простерилизуйте платиновую петлю в пламени горелки.
С помощью петли перенесите червей стадии L4 на каждую RNAi-чашку и инкубируйте в течение ночи при 20 °C, чтобы они перешли в стадию молодых взрослых особей, откладывающих яйца. Затем перенесите молодых взрослых особей на новую RNAi-чашку и инкубируйте в течение 6-8 часов при 20 °C, в течение которых происходит откладка яиц. После удаления всех взрослых особей эти яйца будут синхронизированы по развитию. Наконец, дайте червям вырасти на RNAi-чашках до достижения стадии развития, интересующей для анализа.
Для визуализации червей необходимо подготовить предметное стекло с 4% агаровой подушечкой. Сначала закрепите две предметные пластины маркировочной лентой, создав проставки, которые обеспечат равномерную толщину агарового слоя. Поместите чистое предметное стекло между двумя проставками и пипеткой нанесите на него около 150 μl расплавленного 4% агара. Быстро накройте расплавленный агар другим стеклом перпендикулярно проставкам. Осторожно разделите стекла, после чего агаровая подушечка останется прилипшей к одному из них.
Затем добавьте на агаровую подушечку 10 μl анестетика, например азида натрия, чтобы иммобилизовать животных. С помощью платиновой иглы перенесите червей на агаровую подушечку с анестетиком и накройте покровным стеклом. В завершение исследуйте червей под микроскопом. Сравните червей с нокдауном генов путем РНК-интерференции с контрольной группой и отметьте различия в размере, стадии развития, морфологии, паттернах локализации флуоресцентно меченных белков и других потенциальных фенотипах.
Одним из наиболее ценных применений РНК-интерференции является возможность легко проводить скрининги обратной генетики. Скрининг обратной генетики — это подход к изучению функции гена путем нокдауна известной совокупности генов и оценки полученного фенотипического результата. Например, исследователи могут использовать библиотеку бактерий, экспрессирующих дцРНК почти для всех генов генома C. elegans. Эти бактерии культивируют в многолуночных планшетах и скармливают червям. Затем оценивают фенотипические эффекты РНК-интерференционного нокдауна множества генов, что позволяет получить представление о нормальных функциях генов in vivo.
Автоматизированные генетические скрининги представляют собой тип скрининга обратной генетики с чрезвычайно высокой пропускной способностью. При автоматизированных генетических скринингах можно очень легко осуществить нокдаун всего генома C. elegans, используя роботизированную обработку тысяч бактериальных клонов и специализированные приборы для количественного анализа.
Например, черви, экспрессирующие трансгенный флуоресцентный репортер гена антимикробного пептида nlp 29, подвергаются РНК-интерференционному нокдауну тысяч генов посредством скармливания бактерий. Одновременно червей подвергают воздействию спор грибов. После этого оценивают ответ антимикробного пептида на грибковую инфекцию.
Развитие C. elegans часто изучают с помощью РНК-интерференции. Ученые могут использовать РНК-интерференцию для нокдауна любого интересующего гена (или группы генов) и точно оценить, как этот ген влияет на процессы в ходе развития и/или на сроки развития. Например, нокдаун с помощью РНК-интерференции может выявить гены, подавление которых замедляет развитие, или гены, участвующие в развитии органов.
Вы только что посмотрели вводное видео JoVE по РНК-интерференции у C. elegans. Мы рассмотрели механизм работы РНК-интерференции и способы ее применения у C. elegans путем скармливания бактерий. РНК-интерференция является ценным инструментом для обратного генетического скрининга, включая автоматизированный высокопроизводительный скрининг, а также полезным методом изучения развития. Спасибо за просмотр!
РНК-интерференция, или RNAi, представляет собой широко используемый метод, при котором в организм вводят двухцепочечную РНК, что приводит к направленному сайленсингу генов. Нобелевское открытие РНК-интерференции позволило исследователям подавлять экспрессию любого гена C. elegans для определения его функции. Мы можем индуцировать RNAi у C. elegans, предварительно подготовив чашки с E. coli, экспрессирующими дцРНК целевого гена, которой будут питаться черви. Затем червей на 4-й личиночной стадии переносят на чашки с RNAi и оставляют для откладки яиц. На нужной стадии развития потомство собирают и анализируют на наличие фенотипических признаков.
Технология RNAi часто применяется у C. elegans для проведения обратного генетического скрининга, автоматизированного высокопроизводительного скрининга, а также в качестве инструмента изучения процессов развития. В этом видео мы объясним концепцию РНК-интерференции, продемонстрируем применение метода RNAi у <. elegans> и обсудим, как ученые используют RNAi для более глубокого понимания распространенных биологических процессов.
Для начала разберем принцип работы РНК-интерференции. В случае с C. elegans червям скармливают бактерии, трансформированные плазмидами, которые кодируют двухцепочечную РНК, комплементарную гену, который необходимо заблокировать. Как упоминалось ранее, C. elegans питаются трансформированными бактериями. После проглатывания dsRNA проникает в ткани C. elegans посредством пока неизвестного механизма.
Оказавшись внутри клетки, фермент Dicer расщепляет двухцепочечную РНК на короткие интерферирующие РНК (siRNA) длиной от 21 до 23 нуклеотидов. Затем siRNA связывается с РНК-индуцированным silencing-комплексом, также известным как "RISC", и раскручивается. После этого комплекс siRNA/RISC связывается с целевой мРНК посредством комплементарного спаривания оснований. Это приводит к деградации мРНК, тем самым вызывая нокдаун данного гена.
Перед началом процедуры необходимо подготовить бактерии, экспрессирующие интересующую двухцепочечную РНК. В коммерческой продаже доступны библиотеки бактерий, содержащих плазмиды, кодирующие дцРНК для тысяч генов. В противном случае последовательность целевого гена необходимо клонировать в плазмиду с использованием стандартных методов клонирования. Плазмида содержит ген устойчивости к антибиотику ампициллину, который можно использовать для селекции бактериальных колоний, содержащих плазмиду.
Затем с помощью стандартных методов трансформируйте плазмиду, кодирующую интересующую вас дцРНК, в штамм E. coli (DE3), который будет экспрессировать двухцепочечную РНК. Также трансформируйте бактерии пустой плазмидой в качестве контроля. Важно отметить, что штамм E. coli, используемый в этих экспериментах, лишен РНК-полимеразы III, которая в противном случае расщепляла бы двухцепочечную РНК. Эти бактерии также содержат индуцибельный IPTG ген Т7-ДНК-полимеразы, которая транскрибирует дцРНК в плазмиде. Наконец, бактерии (DE3) устойчивы как к тетрациклину, так и к карбенициллину для поддержания экспрессии РНК-полимеразы III и предотвращения нежелательного роста бактерий.
Высейте трансформированные бактерии HT115(DE3) на чашки с LB-агаром, содержащим 12.5 μg/ml тетрациклина и 25 μg/ml карбенициллина. Инкубируйте в течение ночи при 37 °C; на следующее утро на чашках появятся бактериальные колонии. Затем выберите одну бактериальную колонию и перенесите ее в 1 ml LB-бульона, содержащего 100 μg/ml ампициллина, для селекции бактерий, содержащих плазмиду. Инкубируйте в течение ночи при 37 °C с перемешиванием. После ночной инкубации добавьте в культуру 5 ml LB-бульона, содержащего 100 μg/ml ампициллина, и инкубируйте еще 4-6 часов при 37 °C.
После подготовки бактерий необходимо изготовить чашки с РНК-интерференционными (RNAi) средами для кормления. Чашки для RNAi содержат: агар, воду, карбенициллин, питательную смесь для червей (Worm medium mix) и IPTG для индукции Т7-ДНК-полимеразы в бактериях, которая транскрибирует дцРНК из плазмиды. Добавьте 0,5 ml бактериальной культуры в чашки для RNAi и инкубируйте в течение ночи при 37 °C для создания бактериального газона.
Перед переносом червей на RNAi-чашки важно синхронизировать стадию их развития, чтобы любые наблюдаемые различия в фенотипе не были артефактом стадии развития. Для синхронизации стадий развития сначала простерилизуйте платиновую петлю в пламени горелки.
С помощью петли перенесите червей стадии L4 на каждую RNAi-чашку и инкубируйте в течение ночи при 20 °C, чтобы они перешли в стадию молодых взрослых особей, откладывающих яйца. Затем перенесите молодых взрослых особей на новую RNAi-чашку и инкубируйте в течение 6-8 часов при 20 °C, в течение которых происходит откладка яиц. После удаления всех взрослых особей эти яйца будут синхронизированы по развитию. Наконец, дайте червям вырасти на RNAi-чашках до достижения стадии развития, интересующей для анализа.
Для визуализации червей необходимо подготовить предметное стекло с 4% агаровой подушечкой. Сначала закрепите две предметные пластины маркировочной лентой, создав проставки, которые обеспечат равномерную толщину агарового слоя. Поместите чистое предметное стекло между двумя проставками и пипеткой нанесите на него около 150 μl расплавленного 4% агара. Быстро накройте расплавленный агар другим стеклом перпендикулярно проставкам. Осторожно разделите стекла, после чего агаровая подушечка останется прилипшей к одному из них.
Затем добавьте на агаровую подушечку 10 μl анестетика, например азида натрия, чтобы иммобилизовать животных. С помощью платиновой иглы перенесите червей на агаровую подушечку с анестетиком и накройте покровным стеклом. В завершение исследуйте червей под микроскопом. Сравните червей с нокдауном генов путем РНК-интерференции с контрольной группой и отметьте различия в размере, стадии развития, морфологии, паттернах локализации флуоресцентно меченных белков и других потенциальных фенотипах.
Одним из наиболее ценных применений РНК-интерференции является возможность легко проводить скрининги обратной генетики. Скрининг обратной генетики — это подход к изучению функции гена путем нокдауна известной совокупности генов и оценки полученного фенотипического результата. Например, исследователи могут использовать библиотеку бактерий, экспрессирующих дцРНК почти для всех генов генома C. elegans. Эти бактерии культивируют в многолуночных планшетах и скармливают червям. Затем оценивают фенотипические эффекты РНК-интерференционного нокдауна множества генов, что позволяет получить представление о нормальных функциях генов in vivo.
Автоматизированные генетические скрининги представляют собой тип скрининга обратной генетики с чрезвычайно высокой пропускной способностью. При автоматизированных генетических скринингах можно очень легко осуществить нокдаун всего генома C. elegans, используя роботизированную обработку тысяч бактериальных клонов и специализированные приборы для количественного анализа.
Например, черви, экспрессирующие трансгенный флуоресцентный репортер гена антимикробного пептида nlp 29, подвергаются РНК-интерференционному нокдауну тысяч генов посредством скармливания бактерий. Одновременно червей подвергают воздействию спор грибов. После этого оценивают ответ антимикробного пептида на грибковую инфекцию.
Развитие C. elegans часто изучают с помощью РНК-интерференции. Ученые могут использовать РНК-интерференцию для нокдауна любого интересующего гена (или группы генов) и точно оценить, как этот ген влияет на процессы в ходе развития и/или на сроки развития. Например, нокдаун с помощью РНК-интерференции может выявить гены, подавление которых замедляет развитие, или гены, участвующие в развитии органов.
Вы только что посмотрели вводное видео JoVE по РНК-интерференции у C. elegans. Мы рассмотрели механизм работы РНК-интерференции и способы ее применения у C. elegans путем скармливания бактерий. РНК-интерференция является ценным инструментом для обратного генетического скрининга, включая автоматизированный высокопроизводительный скрининг, а также полезным методом изучения развития. Спасибо за просмотр!
View the full transcript and gain access to JoVE Science Education videos
Q1: How does RNA interference work to silence genes in C. elegans?
Double-stranded RNA enters C. elegans cells after ingestion. The enzyme Dicer cleaves dsRNA into short interfering RNA (siRNA), 21-23 nucleotides long. The siRNA associates with the RNA-induced silencing complex (RISC) and binds target mRNA via complementary base pairing, leading to mRNA degradation and gene knockdown.
Q2: What is the first step in preparing bacteria for RNAi experiments?
Transform the plasmid encoding your target dsRNA into HT115(DE3) E. coli strain, which lacks RNA polymerase III and contains an IPTG-inducible T7 DNA polymerase gene. Also transform bacteria with an empty plasmid as a control. Spread transformed bacteria on LB agar plates containing tetracycline and carbenicillin, then incubate overnight at 37°C.
Q3: Why is worm synchronization important before RNAi treatment?
Synchronizing developmental stages ensures that observed phenotypic differences result from gene knockdown rather than developmental variation. Transfer L4 worms to RNAi plates overnight at 20°C to become young adults, then move them to new plates for 6-8 hours to lay eggs. This produces developmentally synchronized progeny for analysis.
Q4: How do researchers use RNAi to perform reverse genetic screens?
Reverse genetic screens knock down known genes from a library and assess phenotypic results to discover gene function. Researchers culture bacteria expressing dsRNA for many C. elegans genes on multi-well plates and feed them to worms. Phenotypic effects reveal normal in vivo gene functions and can be automated for high-throughput analysis of thousands of genes.
Q5: What happens during the bacterial culture preparation phase?
Select a single bacterial colony and add it to 1 ml LB broth with 100 μg/ml ampicillin. Incubate overnight at 37°C with agitation. Then add 5 ml fresh LB broth with ampicillin and incubate 4-6 hours at 37°C. This culture is then added to RNAi worm plates and incubated overnight at 37°C to create a bacterial lawn.
Q6: What phenotypes can be observed when analyzing RNAi-treated worms?
Compare RNAi knockdown worms with controls and note differences in size, developmental stage, morphology, and localization patterns of fluorescently tagged proteins. Scientists can also assess developmental timing effects, such as genes that delay development when knocked down, or genes involved in organ development and other biological processes.
Q7: How is a microscope slide prepared to visualize C. elegans?
Tape two glass slides with labeling tape as spacers. Place a clean slide between them and pipet 150 μl of 4% molten agar onto it. Cover with a perpendicular slide, then gently separate. Add 10 μl sodium azide anesthetic to the agar pad, transfer worms using a platinum wire pick, add a cover slip, and observe under a microscope.
Главы в этом видео
0:00
Overview
1:21
RNA Interference: The Concept
2:26
Preparing the Bacteria for RNAi in Worms
4:44
Preparing the RNAi Worm Plates and Culturing Worms
6:12
Assessing the Outcome of the RNAi Experiment
7:28
Applications
9:20
Summary