РНК-интерференция у C. elegans

РНК-интерференция, или RNAi, представляет собой широко используемый метод, при котором в организм вводят двухцепочечную РНК, что приводит к направленному сайленсингу генов. Нобелевское открытие РНК-интерференции позволило исследователям подавлять экспрессию любого гена C. elegans для определения его функции. Мы можем индуцировать RNAi у C. elegans, предварительно подготовив чашки с E. coli, экспрессирующими дцРНК целевого гена, которой будут питаться черви. Затем червей на 4-й личиночной стадии переносят на чашки с RNAi и оставляют для откладки яиц. На нужной стадии развития потомство собирают и анализируют на наличие фенотипических признаков.

Технология RNAi часто применяется у C. elegans для проведения обратного генетического скрининга, автоматизированного высокопроизводительного скрининга, а также в качестве инструмента изучения процессов развития. В этом видео мы объясним концепцию РНК-интерференции, продемонстрируем применение метода RNAi у <. elegans> и обсудим, как ученые используют RNAi для более глубокого понимания распространенных биологических процессов.

Для начала разберем принцип работы РНК-интерференции. В случае с C. elegans червям скармливают бактерии, трансформированные плазмидами, которые кодируют двухцепочечную РНК, комплементарную гену, который необходимо заблокировать. Как упоминалось ранее, C. elegans питаются трансформированными бактериями. После проглатывания dsRNA проникает в ткани C. elegans посредством пока неизвестного механизма.

Оказавшись внутри клетки, фермент Dicer расщепляет двухцепочечную РНК на короткие интерферирующие РНК (siRNA) длиной от 21 до 23 нуклеотидов. Затем siRNA связывается с РНК-индуцированным silencing-комплексом, также известным как "RISC", и раскручивается. После этого комплекс siRNA/RISC связывается с целевой мРНК посредством комплементарного спаривания оснований. Это приводит к деградации мРНК, тем самым вызывая нокдаун данного гена.

Перед началом процедуры необходимо подготовить бактерии, экспрессирующие интересующую двухцепочечную РНК. В коммерческой продаже доступны библиотеки бактерий, содержащих плазмиды, кодирующие дцРНК для тысяч генов. В противном случае последовательность целевого гена необходимо клонировать в плазмиду с использованием стандартных методов клонирования. Плазмида содержит ген устойчивости к антибиотику ампициллину, который можно использовать для селекции бактериальных колоний, содержащих плазмиду.

Затем с помощью стандартных методов трансформируйте плазмиду, кодирующую интересующую вас дцРНК, в штамм E. coli (DE3), который будет экспрессировать двухцепочечную РНК. Также трансформируйте бактерии пустой плазмидой в качестве контроля. Важно отметить, что штамм E. coli, используемый в этих экспериментах, лишен РНК-полимеразы III, которая в противном случае расщепляла бы двухцепочечную РНК. Эти бактерии также содержат индуцибельный IPTG ген Т7-ДНК-полимеразы, которая транскрибирует дцРНК в плазмиде. Наконец, бактерии (DE3) устойчивы как к тетрациклину, так и к карбенициллину для поддержания экспрессии РНК-полимеразы III и предотвращения нежелательного роста бактерий.

Высейте трансформированные бактерии HT115(DE3) на чашки с LB-агаром, содержащим 12.5 μg/ml тетрациклина и 25 μg/ml карбенициллина. Инкубируйте в течение ночи при 37 °C; на следующее утро на чашках появятся бактериальные колонии. Затем выберите одну бактериальную колонию и перенесите ее в 1 ml LB-бульона, содержащего 100 μg/ml ампициллина, для селекции бактерий, содержащих плазмиду. Инкубируйте в течение ночи при 37 °C с перемешиванием. После ночной инкубации добавьте в культуру 5 ml LB-бульона, содержащего 100 μg/ml ампициллина, и инкубируйте еще 4-6 часов при 37 °C.

После подготовки бактерий необходимо изготовить чашки с РНК-интерференционными (RNAi) средами для кормления. Чашки для RNAi содержат: агар, воду, карбенициллин, питательную смесь для червей (Worm medium mix) и IPTG для индукции Т7-ДНК-полимеразы в бактериях, которая транскрибирует дцРНК из плазмиды. Добавьте 0,5 ml бактериальной культуры в чашки для RNAi и инкубируйте в течение ночи при 37 °C для создания бактериального газона.

Перед переносом червей на RNAi-чашки важно синхронизировать стадию их развития, чтобы любые наблюдаемые различия в фенотипе не были артефактом стадии развития. Для синхронизации стадий развития сначала простерилизуйте платиновую петлю в пламени горелки.

С помощью петли перенесите червей стадии L4 на каждую RNAi-чашку и инкубируйте в течение ночи при 20 °C, чтобы они перешли в стадию молодых взрослых особей, откладывающих яйца. Затем перенесите молодых взрослых особей на новую RNAi-чашку и инкубируйте в течение 6-8 часов при 20 °C, в течение которых происходит откладка яиц. После удаления всех взрослых особей эти яйца будут синхронизированы по развитию. Наконец, дайте червям вырасти на RNAi-чашках до достижения стадии развития, интересующей для анализа.

Для визуализации червей необходимо подготовить предметное стекло с 4% агаровой подушечкой. Сначала закрепите две предметные пластины маркировочной лентой, создав проставки, которые обеспечат равномерную толщину агарового слоя. Поместите чистое предметное стекло между двумя проставками и пипеткой нанесите на него около 150 μl расплавленного 4% агара. Быстро накройте расплавленный агар другим стеклом перпендикулярно проставкам. Осторожно разделите стекла, после чего агаровая подушечка останется прилипшей к одному из них.

Затем добавьте на агаровую подушечку 10 μl анестетика, например азида натрия, чтобы иммобилизовать животных. С помощью платиновой иглы перенесите червей на агаровую подушечку с анестетиком и накройте покровным стеклом. В завершение исследуйте червей под микроскопом. Сравните червей с нокдауном генов путем РНК-интерференции с контрольной группой и отметьте различия в размере, стадии развития, морфологии, паттернах локализации флуоресцентно меченных белков и других потенциальных фенотипах.

Одним из наиболее ценных применений РНК-интерференции является возможность легко проводить скрининги обратной генетики. Скрининг обратной генетики — это подход к изучению функции гена путем нокдауна известной совокупности генов и оценки полученного фенотипического результата. Например, исследователи могут использовать библиотеку бактерий, экспрессирующих дцРНК почти для всех генов генома C. elegans. Эти бактерии культивируют в многолуночных планшетах и скармливают червям. Затем оценивают фенотипические эффекты РНК-интерференционного нокдауна множества генов, что позволяет получить представление о нормальных функциях генов in vivo.

Автоматизированные генетические скрининги представляют собой тип скрининга обратной генетики с чрезвычайно высокой пропускной способностью. При автоматизированных генетических скринингах можно очень легко осуществить нокдаун всего генома C. elegans, используя роботизированную обработку тысяч бактериальных клонов и специализированные приборы для количественного анализа.

Например, черви, экспрессирующие трансгенный флуоресцентный репортер гена антимикробного пептида nlp 29, подвергаются РНК-интерференционному нокдауну тысяч генов посредством скармливания бактерий. Одновременно червей подвергают воздействию спор грибов. После этого оценивают ответ антимикробного пептида на грибковую инфекцию.

Развитие C. elegans часто изучают с помощью РНК-интерференции. Ученые могут использовать РНК-интерференцию для нокдауна любого интересующего гена (или группы генов) и точно оценить, как этот ген влияет на процессы в ходе развития и/или на сроки развития. Например, нокдаун с помощью РНК-интерференции может выявить гены, подавление которых замедляет развитие, или гены, участвующие в развитии органов.

Вы только что посмотрели вводное видео JoVE по РНК-интерференции у C. elegans. Мы рассмотрели механизм работы РНК-интерференции и способы ее применения у C. elegans путем скармливания бактерий. РНК-интерференция является ценным инструментом для обратного генетического скрининга, включая автоматизированный высокопроизводительный скрининг, а также полезным методом изучения развития. Спасибо за просмотр!