дрозофила Личиночный ИГЦ

Drosophila melanogaster является широко изученным модельным организмом благодаря своей универсальности и удобству использования.

Иммуногистохимия, проводимая на препаратах личинок дрозофилы, является бесценным методом, который может предоставить информацию о наличии, локализации и колокализации белков.

В этом видео будут рассмотрены основные методы вскрытия, фиксации, блокирования и монтирования тканей личинок дрозофилы, а также примеры их применения.

Иммуногистохимия — это процесс, в котором используются модифицированные антитела для нацеливания, связывания и, в конечном итоге, визуализации конкретных белков в тканях.

Иммуногистохимия личинки дрозофилы зависит от правильного вскрытия, что требует точности и своевременности из-за чувствительности личиночной ткани.

Диссекция обычно проводится в фосфатно-солевом буфере, или сокращенно «PBS».

При извлечении органы временно помещают в ПБС – солевой раствор с таким же рН, как и внутренний рН личинки.

После вскрытия следующим этапом у личинки дрозофилы ИГХ является фиксация.

Фиксация – это процесс, при котором ткань помещается в разбавленный раствор на основе формальдегида, который сохраняет ткань.

Этот фиксирующий раствор предотвращает ферментативное расщепление белков в тканях.

После фиксации происходит несколько этапов промывания в течение всего процесса иммуноокрашивания с использованием PBS, содержащего Triton-X, называемого PBST.

Triton-X100 содержит небольшое количество моющего средства, которое служит прерывателем поверхностного натяжения и проникает в клетку, позволяя антителам и другим реагентам проникать внутрь.

После фиксации и промывания ткань готова к блокировке.

Блокирующий раствор содержит белки, которые связываются с тканью и занимают неспецифические сайты связывания, к которым в противном случае прилипли бы специфические антитела-мишени. Блокировка помогает предотвратить ложноположительный сигнал белка.

После блокировки ткань подготавливается к окрашиванию.

Окрашивание включает в себя высокоспецифичное «первичное» антитело, которое связывается с белком-мишенью, называемым антигеном.

«Вторичное» антитело, конъюгированное с репортерной молекулой, связывается с первичным антителом.

Репортерная молекула излучает локализованный сигнал, который можно визуализировать, и который часто является флуоресцентным по своей природе.

После каждого этапа инкубации антител избыток антител смывается для удаления любых антител, которые неспецифически связывались.

После процесса окрашивания образец необходимо смонтировать.

Для того чтобы увидеть результаты окрашивания, ткань необходимо аккуратно закрепить на предметных стеклах.

Для оболочки ткани используется густой реагент или монтажная среда.

После этого образец готов к просмотру под микроскопом.

Теперь, когда мы рассмотрели принципы иммуногистохимии дрозофилы, мы готовы увидеть, как это делается.

В этом видео мы сосредоточимся на реагентах, инструментах и процессах, используемых в иммуногистохимии мозга личинок дрозофилы, начиная с фиксации.

Процесс, за которым мы следим, задействует весь мозг и известен как окрашивание всего крепления.

Несмотря на то, что процедура диссекции отличается в зависимости от типа ткани, используемой для эксперимента, основные этапы ИГХ остаются теми же, поэтому мы перейдем к этапу фиксации.

После того, как вскрытие мозга личинок будет завершено, удалите PBS с помощью пипетки.

Добавьте фиксатор и инкубируйте в соответствии с вашим конкретным протоколом, для мозга используйте 23 минуты.

После фиксации промыть образцы четыре раза в ПБСТ.

Образцы инкубировать в блокирующем растворе не менее 30 минут при комнатной температуре.

Используя соответствующие разведения, инкубировать в первичном растворе антитела в течение ночи при 4 °C.

После инкубационного периода четыре раза промыть мозги в ПБСТ с помощью наконечника для пипетки при комнатной температуре.

Инкубируйте образцы во вторичном антителе в течение ночи при 4 °C в темноте, чтобы предотвратить обесцвечивание флуорофоров.

Снова четыре раза промыть мозги в PBST.

Уравновесьте мозги в монтажной среде в течение часа.

После равновесия перенесите мозги на предметное стекло с помощью пипетки p200 с отрезанным кончиком.

Поместите распорки вокруг образца, чтобы предотвратить его раздавливание.

Наденьте на образцы покровную крышку.

Заклейте края слипа лаком для ногтей. Мозг личинок теперь готов к визуализации с помощью иммуногистохимии

Теперь, когда мы рассмотрели иммуногистохимию мозга дрозофилы, давайте рассмотрим некоторые альтернативные способы применения процедур ИГХ.

Альтернативные методы препарирования и фиксации могут быть использованы для подготовки личинки дрозофилы к визуализации.

В этом эксперименте исследователи хотят узнать, как клетки генерируют определенные формы.

Они делают это, отслеживая морфологию личиночных трахеальных терминальных клеток.

Исследователи используют в своих интересах мутантную линию мух, которая экспрессирует GFP.

Экспрессия GFP индуцируется воздействием тепла в водяной бане

Личинки отбирают под вскрытием микроскопа с флуоресценцией.

Мухи, испускающие флуоресценцию, указывают на успешную активацию GFP.

Эти мухи подвергаются альтернативной форме фиксации с помощью тепла; вскрытие не требуется.

После использования программного обеспечения для помощи в отслеживании идентифицируется клеточная морфология ветвей трахеи и просвета.

Яичник дрозофилы является отличной моделью для понимания того, как стволовые клетки взаимодействуют с клеточной средой.

ИГХ яичников дрозофилы начинается с идентификации самок дрозофилы по наличию яичников в сравнении с семенниками, которые проявляются у самцов.

Собранные личинки самок переносятся в отдельные лунки, где их тщательно препарируют, чтобы получить структуру, известную как жировое тело, в котором находятся яичники.

Жировые тела фиксируются и окрашиваются, а затем – после размещения ткани на предметных стеклах – яичники отделяются от жировой ткани тела. После монтажа и визуализации предметных стекол флуоресцентное окрашивание выявляет расположение соматических клеток и первичных половых клеток в личиночном яичнике.

Иммуногистохимия личинок дрозофилы имеет много параллелей с ИГХ куколки и взрослой особи.

Например, исследователи могут использовать ИГХ для изучения сетчатки дрозофилы на разных стадиях развития: личиночной, куколочной и взрослой, тем самым иллюстрируя разницу между процедурами иммуногистохимии куколки, личинки и взрослого человека.

Результаты показывают различные стадии развития сетчатки дрозофилы.

Иммуногистохимия личинки дрозофилы – это инструмент с большим количеством применений и вариаций. В этом видео мы рассмотрели процедуры иммуноокрашивания личинок, включая вскрытие, фиксацию, окрашивание и крепление. Спасибо за просмотр!