ИГХ личинок Drosophila

Drosophila melanogaster является широко изучаемым модельным организмом благодаря своей универсальности и удобству в использовании.

Иммуногистохимический анализ препаратов личинок Drosophila представляет собой неоценимый метод, позволяющий получить информацию о наличии, локализации и ко-локализации белков.

В данном видео будут рассмотрены основные методы препарирования, фиксации, блокирования и монтирования тканей личинок Drosophila, а также приведены примеры их применения.

Иммуногистохимия представляет собой процесс, в котором используются модифицированные антитела для нацеливания, связывания и последующей визуализации специфических белков в ткани.

Иммуногистохимический анализ личинок Drosophila основывается на правильном препарировании, которое требует точности и оперативности из-за чувствительности тканей личинки.

Препарирование обычно проводится в фосфатно-солевом буферном растворе, или сокращенно «PBS».

После извлечения органы временно помещают в PBS — солевой раствор, pH которого соответствует внутреннему pH личинки.

Следующим этапом иммуногистохимии личинок Drosophila после препарирования является фиксация.

Фиксация — это процесс, при котором ткань помещают в разбавленный раствор на основе формальдегида, который консервирует ткани.

Этот фиксирующий раствор предотвращает ферментативное расщепление белков в ткани.

После фиксации на протяжении всего процесса иммуноокрашивания выполняют несколько этапов промывки с использованием PBS, содержащего Triton-X, который называется PBST.

Triton-X100 содержит небольшое количество детергента, который снижает поверхностное натяжение и пермеабилизирует клетку, позволяя антителам и другим реагентам проникать внутрь.

После фиксации и промывки ткань готова к блокировке.

Раствор для блокировки содержит белки, которые связываются с тканью и занимают неспецифические сайты связывания, к которым в противном случае могли бы прикрепиться специфические антитела. Блокировка помогает предотвратить появление ложноположительного белкового сигнала.

После блокировки ткань подготавливают к окрашиванию.

Окрашивание включает использование высокоспецифичных «первичных» антител, которые связываются с целевым белком, называемым антигеном.

«Вторичное» антитело, конъюгированное с репортерной молекулой, связывается с первичным антителом.

Репортерная молекула испускает локализованный сигнал, который можно визуализировать; часто этот сигнал является флуоресцентным.

После каждого этапа инкубации с антителами излишки антител отмывают, чтобы удалить все молекулы, связавшиеся неспецифически.

После процесса окрашивания образец необходимо смонтировать.

Для того чтобы увидеть результаты окрашивания, ткань необходимо осторожно нанести на предметные стекла.

Для заключения ткани в каплю используют густой реагент или среду для заключения (монтажную среду).

После этого образец готов к рассмотрению под микроскопом.

Теперь, когда мы изучили принципы иммуногистохимии Drosophila, мы готовы увидеть, как это выполняется на практике.

В этом видео мы подробно рассмотрим реагенты, инструменты и процессы, используемые при иммуногистохимическом анализе мозга личинок Drosophila, начиная с этапа фиксации.

Применяемый нами метод предполагает использование всего мозга и известен как окрашивание целого препарата.

Хотя процедура диссекции различается в зависимости от типа ткани, используемой в эксперименте, основные этапы ИГХ остаются неизменными, поэтому мы перейдем сразу к этапу фиксации.

После завершения диссекции мозга личинок удалите PBS с помощью пипетки.

Добавьте фиксатор и инкубируйте согласно вашему конкретному протоколу; для мозга используйте время 23 min.

После фиксации четырежды промойте образцы в PBST.

Инкубируйте образцы в блокирующем растворе не менее 30 min при комнатной температуре.

Используя соответствующие разведения, инкубируйте в растворе первичных антител в течение ночи при 4 °C.

После периода инкубации четырежды промойте мозг в PBST с помощью наконечника пипетки при комнатной температуре.

Инкубируйте образцы со вторичными антителами в течение ночи при 4 °C в темноте, чтобы предотвратить выцветание флуорофоров.

Снова четырежды промойте мозг в PBST.

Выдержите мозг в среде для заключения препарата в течение одного часа для уравновешивания.

После уравновешивания перенесите мозг на предметное стекло, используя пипетку p200 с обрезанным наконечником.

Разместите вокруг образца спейсеры, чтобы предотвратить его раздавливание.

Накройте образцы покровным стеклом.

Загерметизируйте края стекла лаком для ногтей. Теперь мозг личинок готов к визуализации с помощью иммуногистохимии.

Теперь, когда мы рассмотрели иммуногистохимию мозга Drosophila, давайте изучим альтернативные способы применения процедур ИГХ.

Для подготовки личинок Drosophila к визуализации могут быть использованы альтернативные методы препарирования и фиксации.

В данном эксперименте исследователи стремятся выяснить, как клетки формируют определенные формы.

Для этого они прослеживают морфологию терминальных клеток трахей личинок.

Исследователи используют мутантную линию мух, экспрессирующую GFP.

Экспрессия GFP индуцируется воздействием тепла в водяной бане.

Личинки отбирают с помощью диссекционного микроскопа с флуоресценцией.

Флуоресценция мух свидетельствует об успешной активации GFP.

Таких мух подвергают альтернативному виду тепловой фиксации; препарирование не требуется.

С помощью программного обеспечения для трейсинга определяют морфологию клеток трахейных ветвей и просвета.

Яичник Drosophila является отличной моделью для понимания того, как стволовые клетки взаимодействуют с клеточным окружением.

ИГХ яичников Drosophila начинается с идентификации самок Drosophila по наличию яичников в противовес семенникам, которые видны у самцов.

Собранных личинок самок переносят в отдельные лунки, где проводят аккуратное препарирование для выделения структуры, известной как жировое тело, в котором расположены яичники.

Жировые тела фиксируют и окрашивают, а затем, после размещения ткани на предметных стеклах, яичники отделяют от ткани жирового тела. После монтирования и визуализации стекол флуоресцентное окрашивание позволяет определить локализацию соматических клеток и примордиальных половых клеток в яичнике личинки.

Иммуногистохимия личинок Drosophila во многом схожа с ИГХ куколок и взрослых особей.

Например, исследователи могут использовать ИГХ для изучения сетчатки Drosophila на разных стадиях развития: личиночной, куколочной и взрослой, иллюстрируя тем самым различия между процедурами иммуногистохимии куколок, личинок и взрослых особей.

Результаты демонстрируют различные стадии развития сетчатки Drosophila.

Иммуногистохимический анализ личинок Drosophila — это инструмент с широким спектром применений и модификаций. В данном видео мы рассмотрели процедуры иммуноокрашивания личинок, включая диссекцию, фиксацию, окрашивание и монтирование. Спасибо за просмотр!