Метод изучения влияния химически индуцированного угасание функции яичников на толерантность к физической нагрузке и кардиохирургии адаптации у мышей

Общая цель данной процедуры — ускорить естественный процесс фолликулярной атрезии в яичниках, что приведет к яичниковой недостаточности, истощению запасов эстрогена и прекращению менструального цикла у самки, создавая состояние, которое точно имитирует менопаузу. Это достигается путем первоначального введения в течение 15–20 дней подряд химического вещества винилциклодиоксида или VCD, который, как было показано, специфически воздействует на малые первичные и примордиальные фолликулы яичников и разрушает их, ускоряя естественный процесс атрезии. Вторым этапом является определение эстрального цикла и цикличности яичников с помощью вагинальной цитологии, начиная примерно через шесть недель после начала инъекций VCD.

Для подтверждения прекращения циклов и развития яичниковой недостаточности по данным вагинальной цитологии необходимо наблюдать сохранение стадии диэструса или отсутствие циклов в течение 15–20 дней. Заключительным этапом является внедрение воздействия, на которое может повлиять менопауза или переход к ней, такого как произвольное беговое колесо в клетке и сердечная адаптация. В конечном итоге активность в беговом колесе и сердечная адаптация используются для определения того, приводит ли менопауза к снижению активности в колесе.

Основное преимущество данного метода перед существующими подходами, такими как эктомия, заключается в том, что эктомия представляет собой хирургическую процедуру, приводящую к резкому снижению уровня эстрогена, что отличается от естественного постепенного снижения уровня этого гормона, происходящего при переходе от пременопаузы к постменопаузе. Значение данной методики распространяется на терапию метаболических и сердечно-сосудистых заболеваний у женщин в период постменопаузы, поскольку такие пациентки более подвержены метаболическому синдрому и связанным с ним сопутствующим патологиям, включая сердечно-сосудистые заболевания, по сравнению с женщинами в период пременопаузы. Визуальная демонстрация этого метода имеет решающее значение, так как этапы вагинальной цитологии трудно освоить, поскольку требуется строгое соблюдение техники взятия мазка и правильная идентификация цикла EST.

4. Винилциклодиоксид (VCD) хранят при температуре -20 °C. Для подготовки VCD к протоколу инъекции добавьте 0,587 мл VCD в чистый дозирующий флакон, доведите конечный объем до 10 мл кунжутным маслом, плотно закройте флакон парафильмом и аккуратно перемешайте путем инверсии. Хранить при температуре 4 °C не более семи дней.

Для начала протокола введения VCD в течение 20 дней подряд взвешивайте двухмесячных мышей, ежедневно вводя внутрибрюшинно VCD комнатной температуры в дозе 160 мг/кг, используя иглу 27-го калибра в течение всего периода инъекций. Старайтесь чередовать места инъекций, чтобы снизить вероятность локального инфицирования. Контрольным мышам вводите раствор носителя — кунжутное масло — в объеме 2,5 мл/кг после завершения периода инъекций.

Ежедневно контролируйте цикл эструса, беря вагинальные мазки. Одним из факторов, критически важных для успеха данного исследования, является получение высококачественных вагинальных мазков для цитологического анализа. Фиксируйте мышей, удерживая их за загривок.

Введите в вагинальное отверстие на глубину 0,5 сантиметра пипетку с 0,2 миллилитрами стерильного физиологического раствора. Трижды перемешайте введенный раствор с помощью пипетки, затем нанесите одну каплю на чистый предметное стекло. Немедленно оцените каждый образец микроскопически с использованием стандартного светового микроскопа при 100-кратном увеличении для подтверждения ovarian failure.

Впоследствии мыши с индуцированной VCD менопаузой используются для экспериментов с физическими нагрузками. Установка с беговым колесом состоит из колеса диаметром 11,5 сантиметров с беговой поверхностью шириной пять сантиметров, оснащенного цифровым магнитным счетчиком, который активируется при вращении колеса. Перед каждым использованием бегового колеса проведите его калибровку в соответствии с инструкциями производителя.

Измерьте внутренний диаметр бегового колеса. Вычислите длину окружности и введите это значение в цифровой счетчик как размер колеса. Чтобы закрепить колесо в клетке, просуньте стойку колеса через верхнюю часть проволочного каркаса клетки для животных.

Закрепите стойку для колеса на проволоке клетки с помощью зажимов для бумаг. Зажимы должны быть расположены в верхней части проволоки, вдали от животного. Пропустите компьютерную часть и любой излишек кабеля сквозь проволоку клетки.

Расположите компьютер и лишний кабель вне зоны досягаемости животного. Этого можно добиться, поместив пластиковую чашу для взвешивания среднего размера поверх проводов клетки, чтобы зафиксировать компьютер и избыточный кабель. Затем прикрепите блок управления цифрового магнитного счетчика к стойке колеса.

С помощью изоленты прикрепите свободный магнит цифрового магнитного счетчика к центральной перекладине с той же стороны, где расположен кабель, соединяющий магнит с компьютером. При этом используйте достаточное количество изоленты, чтобы защитить магнит от повреждений в результате разгрызания. Магнит должен быть расположен таким образом, чтобы каждый оборот колеса регистрировался компьютером без каких-либо помех или сопротивления полному вращению колеса.

Прикрепите беговое колесо к основанию. Установите подставку, вставив стойки в монтажные отверстия центральных перекладин колеса. Убедитесь, что колесо может свободно вращаться.

За установкой следует наблюдать ежедневно на предмет повреждений в результате перегрызания и по мере необходимости производить ремонт. Для эксперимента самки инбредных мышей линии C57BL/6 и гибридов B6C3F1 в возрасте семи месяцев из одного помета случайным образом распределяют в группу с режимом физических упражнений или в группу малоподвижного контроля. Экспериментальных животных содержат индивидуально в клетках размером 47 × 26 × 14,5 см с беспрепятственным доступом к беговому колесу в течение 28 дней; животных контрольной группы содержат совместно в клетке без колеса.

Обеспечьте всех животных водой и стандартным твердым кормом для грызунов. Вручную добавляйте лидокаин, ежедневно фиксируя показатели пройденного расстояния и общего времени бега, предоставляемые магнитным счетчиком; для получения точных и согласованных данных на протяжении всего 28-дневного периода физических нагрузок фиксируйте значения расстояния и времени ежедневно в один и тот же одночасовой интервал. После завершения ежедневных записей обнуляйте магнитный счетчик, чтобы обеспечить точность показаний на следующий день.

По окончании определенного периода физических нагрузок записывают массу тел эвтаназированных животных перед забором тканей. Чтобы извлечь сердце, сделайте медианный разрез на вентральной стороне, вскройте диафрагму и быстро визуализируйте сердце. Вырежьте сердце у основания и поместите в холодный фосфатно-солевой буферный раствор, чтобы достаточно вымыть остатки крови из желудочков. Удалите с сердца излишки тканей, взвесьте сердце целиком и, при необходимости, подвергните мгновенной заморозке в жидком азоте.

Соберите дополнительные образцы тканей, промойте их модифицированным охлажденным до 0 °C фосфатно-солевым буферным раствором, а затем подвергните мгновенной заморозке в изопентане, охлажденном в жидком азоте. В данном исследовании яичниковая недостаточность была индуцирована воздействием VCD и подтверждена микроскопическим исследованием вагинальных мазков. Стадия эструсного цикла определяется по соотношению эпителиальных клеток, количеству эпителиальных клеток и лейкоцитов; в PROE преобладают ядерные эпителиальные клетки.

Здесь стрелки указывают на ядра в клетках в период эструса; клетки преимущественно представляют собой безъядерные плоскоклеточные эпителиальные клетки. Период метаэструса характеризуется смешанным типом клеток с преобладанием лейкоцитов. В период диэструса доминируют лейкоциты.

Эстральный цикл у мышей до введения VCD обычно длится четыре дня. Животные считались ациклическими после 15 дней стойкого диэструса. На данном рисунке показана средняя продолжительность эстрального цикла в днях для групп, вводивших растворитель и VCD.

Один цикл отсчитывается от первого дня эструса до первого дня следующего периода. Вагинальная цитология в фазе эструса была начата примерно через шесть недель после начала инъекций. Было отмечено, что циклы эструса у животных, получавших VCD, стали нерегулярными по сравнению с животными, получавшими плацебо; после 12 циклов эструса цитология всех животных, в которых вводили VCD, перестала указывать на наличие циклов по завершении протокола инъекций VCD. Окрашивание гематоксилином и эозином поперечных срезов ткани яичников выявило значительную атрофию ткани яичников у животных, получавших VCD, по сравнению с контрольной группой.

При рассмотрении при 20-кратном и 200-кратном увеличении в ткани, обработанной VCD, наблюдалось полное истощение первичных и примордиальных фолликулов. Для изучения влияния вызванной VCD яичниковой недостаточности на физическую работоспособность семимесячных мышей двух линий, получавших VCD или плацебо, ежедневно регистрировались показатели времени и дистанции бега в колесе для каждого животного в течение четырехнедельного периода физических нагрузок. На данном рисунке представлены еженедельные средние значения ежедневного бега по дистанции, времени и скорости.

Для мышей линии C 57BL/6, получавших либо препарат-плацебо (vehicle), либо VCD, не было обнаружено значимых различий в физической активности, измеряемой по среднесуточному расстоянию пробега и времени нахождения на колесе, между группами, получавшими VCD и плацебо, как для линии C 57BL/6, так и для гибридной линии B6C3F1. Это указывает на то, что влияние вызванной VCD яичниковой недостаточности на добровольную физическую активность на беговом колесе проявляется по крайней мере у двух линий мышей по завершении протокола добровольных упражнений. Были зафиксированы морфометрические показатели тела, после чего сердца были быстро извлечены и взвешены, что согласуется с предыдущими наблюдениями.

Была отмечена гипертрофия миокарда в ответ на физические нагрузки на беговом колесе в клетке, которая оценивалась по абсолютной массе сердца и массе сердца, нормированной по длине большеберцовой кости. Несмотря на то что абсолютная масса сердца и отношение массы сердца к длине большеберцовой кости были значительно выше у мышей, получавших плацебо и VCD, по сравнению с малоподвижными контрольными животными, измеримых различий в гипертрофии миокарда между контрольной группой и группой с индуцированной VCD яичниковой недостаточностью выявлено не было. В завершение, после добровольных упражнений на беговом колесе в клетке, мыши, получавшие VCD и плацебо, были подвергнуты принудительному бегу на беговой дорожке для определения их способности к физическим нагрузкам как высокой, так и низкой интенсивности.

В протоколе с высокой интенсивностью средняя скорость беговой дорожки ступенчато увеличивали каждые 10 минут до появления у мышей признаков истощения. В среднем максимальная скорость мышей, получавших плацебо, составила 26,7 ± 0,95 м/мин, а максимальная скорость мышей, получавших VCD, до наступления истощения составила 28 ± 1,4 м/мин. Для оценки выносливости использовался бег с низкой интенсивностью при скорости 20 м/мин.

В среднем максимальное время до наступления истощения у мышей, получавших плацебо, составило 28,3 ± 1,3 минуты, а у мышей, получавших VCD, — 29,7 ± 1,4 минуты. Между группами, получавшими плацебо и VCD, не было обнаружено значимых различий в способности к физическим нагрузкам высокой или низкой интенсивности, что указывает на отсутствие влияния вызванной VCD яичниковой недостаточности на выносливость мышей. После разработки эта методика открыла исследователям в области клеточных, молекулярных и физиологических наук путь к изучению роли менопаузы у грызунов.

После просмотра этого видео вы должны четко понимать, как правильно выполнять инъекции VCD, проводить вагинальную цитологию и осуществлять физиологическое вмешательство.