Оптимизация высококлассной глиомы клеточной культуры от хирургических образцов для использования в клинически значимых животных моделях и 3D иммунохимии

Общая цель этой процедуры заключается в развитии рутинной неврозной сферы, культивировании астроцитом высокой степени злокачественности и широкомасштабной экспансии опухолевых клеток для доклинических исследований. Это достигается путем сначала острой диссоциации свежих образцов опухоли и отделения отдельных клеток от эритроцитов и мусора. На втором этапе опухолевые клетки культивируются в неврозной сфере, в среду добавляются факторы роста до тех пор, пока не будут наблюдаться нейросферы.

Нейросферы могут быть культивированы для экспериментов in vivo и молекулярной характеризации или формальными и фиксированными и встроенными в парафин для иммунологической характеристики. В конечном счете, можно оценить долгосрочное самообновляющееся ортотопическое образование опухолей и молекулярное профилирование культур нейросферы. Основное преимущество перед существующими методами, такими как 10% FBS для долговременных культур сыворотки, заключается в том, что этот метод сохраняет молекулярные и генетические характеристики исходной опухоли.

Этот метод делает возможным создание банка живых опухолей для создания специфических для пациента культур клеток глиобластомы и животных моделей для клинически значимых исследований. Значение этой модели для терапевтического тестирования пациентов со злокачественной глиомой очевидно. Модель наиболее точно представляет первичную опухоль и позволяет проводить терапевтические испытания в доклинических условиях.

Хотя этот метод может дать представление о глиомах высокой степени злокачественности, он также может быть применен к другим опухолям человека и животных. Как правило, люди, плохо знакомые с этим методом, будут испытывать трудности, потому что он требует надлежащих стерильных методов и ухода, а также нескольких шагов для обеспечения долгосрочной жизнеспособности клеток. Впервые у нас появилась идея метода 3D-гистологии из-за превосходной субклеточной локализации меченых белков и срезов по сравнению с более распространенными методами маркировки и визуализации целых нейросфер или диссоциации клеток.

Визуальная демонстрация этого метода гистологии имеет решающее значение, поскольку этапы фиксации, очистки, обработки и встраивания трудно изучить. Необходимо позаботиться о том, чтобы все нейросферы адекватно подвергались воздействию реагентов и равномерно обрабатывались, давая наилучшие доступные гранулы для морфологии и иммуногистохимии. Начиная с 200-500 миллиграммов образца опухоли, используйте лезвие скальпеля, чтобы измельчить ткань.

Переложите кусочки в 15-миллилитровую трубку, содержащую 10 миллилитров среды, а затем несколько раз переверните суспензию, чтобы перемешать тканевый раствор. Дайте кусочкам опухоли осесть под действием силы тяжести, а затем удалите среду. Продолжайте смывать мусор с кусочков опухоли до тех пор, пока среда не перестанет быть турной.

Далее удалите среду. Добавьте два миллилитра раствора для ферментативной диссоциации тканей на 0,5 грамма смешанного образца опухоли и аккуратно перемешайте раствор путем инверсии. Инкубируйте тканевый раствор при температуре 37 градусов Цельсия в инкубаторе для тканевых культур при вращении.

Через 30 минут три-растерзают суспензию с помощью двухмиллилитровой пипетки. Когда опухоль расщепляется до преимущественно одноклеточной суспензии, остановите ферменты двумя объемами стоп-раствора и смешайте клеточную суспензию с помощью пятимиллилитровой серологической пипетки. Теперь отфильтруйте любой непереваренный материал через сетчатое фильтр с 40 микрометрами и гранулируйте клетки в течение пяти минут при температуре 800 G и комнатной температуре.

Затем после трех промывок в 10 миллилитрах среды, резус, суспензируют конечную клеточную гранулу в пяти миллилитрах среды. Медленно нанесите эту клеточную суспензию на пять миллилитров лимфосветного М, а затем разделите клеточные популяции на 20 минут при 1300-кратном G и комнатной температуре. Теперь соберите слой интерфейса, содержащий ядрообразные клетки, в 15-миллилитровую пробирку, содержащую 10 миллилитров среды.

Затем ресуспензируют клетки в среде неврозной сферы, дополненной факторами роста, и пластинируют их в соотношении менее одного умноженного на 10-ю клетку на миллилитр. В неправильной колбе для культуры тканей Т 25 при 37 градусах Цельсия и 5% углекислом газе. В инкубаторе для культуры увлажненных тканей.

Перенесите плавающие нейросферы, которые формируются в течение одной-трех недель, в свежую колбу, чтобы отделить их от прикрепленных клеток и мусора. Для анализа нейросфер с помощью иммуногистохимии сначала оболочивают нейросферы, а затем следят за тем, чтобы не потревожить гранулу. Снимите надосадочную жидкость и добавьте в трубку 10 миллилитров DPBS.

Затем удалите DPBS, повторно суспендируйте гранулу в 10% нейтральном буферизованном формине и инкубируйте клетки в течение 20 минут при комнатной температуре. После повторного гранулирования стероидов повторно суспендируйте их в серии инкубаций этанола. После второй инкубации с 95% этанолом ресуспендируют PHE с абсолютным этанолом до тех пор, пока клетки не станут яркими, белыми и конденсированными.

Далее сделайте небольшой конус из линзовой бумаги. Поместите его в небольшую воронку внутри стакана и смочите бумагу для линз абсолютным спиртом. Слегка разрыхлите гранулу свежим 100% этанолом, а затем слейте излишки спирта.

Вылейте шарики через бумажный конус для линзы, убедившись, что они идут к кончику, и промойте трубку дополнительным абсолютным этанолом. Влейте остатки стероида через бумажный конус для линз, а затем извлеките конус из воронки. Затем сложите бумагу для линз в квадрат, убедившись, что стероиды максимально надежно закрыты, и перенесите пакет нейросфер в кассету.

Теперь поместите кассету в автоматический процессор для салфеток и запустите процессор. Затем снимите кассету и поместите ее на нагретую часть системы заделки парафина. Убедившись, что на поверхности нет осколков, пыли или другого мусора, откачайте весь парафин из щипцов в утепляющие лунки.

Затем нагрейте пару чистых щипцов без парафина и добавьте небольшое количество парафина в нагретую форму для основания. Теперь извлеките пакет из кассеты и поместите его на нагретую часть встраиваемой системы. Осторожно раскройте бумагу до тех пор, пока не станут видны штурвалки.

С помощью предварительно подогретых щипцов соберите как можно больше материала, а затем перенесите сфероиды в жидкий парафин в базовой форме. Осторожно разбейте любые комочки и переместите стероид от углов в равномерный центральный слой. Переместите форму основания в зону охлаждения, чтобы закрепить стероид на месте.

Наконец, добавьте кассету и медленно заполните ее парафином. После того, как кассета полностью охладится, парафиновый блок нейросферы может быть разрезан для иммуногистохимии, как описано в таблице. Эффективность данного протокола для создания долгосрочных культур неврозной сферы из 88 впервые диагностированных и 37 рецидивирующих опухолей составила 41,6%, что аналогично как для впервые диагностированных, так и для рецидивирующих опухолей.

Для некоторых образцов глиобластомы нейросферы сформировались в течение первых нескольких дней, в то время как для других требовалось более длительное время культивирования. Эффективность формирования неврозной сферы зависела не только от уровня некроза в ткани, о чем свидетельствуют результаты недавно диагностированной опухоли с высокой плотностью клеток, а также рецидивирующей и некротической опухоли, обработанных так, как только что продемонстрированные, и дающих нейросферы, проверяющие опухолевый потенциал каждой невросферы. Культивирование на мышах с ослабленным иммунитетом является решающим подтверждением этого подхода для обогащения раковых стволовых клеток.

В этом эксперименте в мозг мышей с ослабленным иммунитетом были имплантированы две разные культуры сферы нейробов глиобластомы. Опухоли ксенотрансплантата имели морфологические характеристики глиобластом, такие как инвазия в мозг, паренхима и некроз. В этом эксперименте клетки, которые не образовывали нейросферы, культивировались в среде нейросфер с добавлением 2% FBS, опухолевого образования этих клеток альтернативных сред.

По сравнению с глиобластомой, оценивали ксенотрансплантат нейросфер у голых мышей-реципиентов. Никаких различий в выживаемости. Динамику роста опухоли или морфологию наблюдали между двумя методами предпосевного культивирования.

В то время как маркеры нейральных стволовых клеток, включая SOX 2, подавляются в большинстве первичных клеток глиобластомы, культивируемых в клетках глиобластомы 10% FBS, выращенных в среде нейросфер, дополненные 2% FBS, сохраняют экспрессию SOX 2 после обработки, как только что продемонстрировано. В этом эксперименте нейросферы были помечены антителами h и e antiox two для демонстрации ядерной локализации и антителами эпидермального фактора роста для иллюстрации локализации клеточной мембраны. Как показывают полученные изображения, продемонстрированный метод оптимизирует анализ экспрессии белка и посттрансляционных модификаций при сохранении 3D-архитектуры нейросфер После освоения эта техника диссоциации тканей может быть выполнена примерно за два часа при правильном выполнении При попытке процедуры важно помнить, что временной интервал между операцией и ассоциацией, а также гетерогенный молекулярный состав глиом высокой степени злокачественности может повлиять на исход после этой процедуры.

Другие методы, такие как внутричерепная имплантация, могут быть выполнены для того, чтобы повторить исходную опухоль на животных моделях. Этот метод произвел революцию в нейроонкологии, позволив проводить доклинические испытания в клинически значимых условиях. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее понимание того, как развивать и поддерживать долгосрочные нейросферы, а также как производить формальные и фиксированные нейросферы с парафином для молекулярного анализа.

Не забывайте, что работа с человеческими тканями может быть чрезвычайно опасной, и при выполнении этой процедуры всегда следует использовать такие меры предосторожности, как индивидуальная защита, совместимые и потенциально опасные вещества.