Ортотопическая Глиобластома мышь Модель Поддержание Мозг паренхимы физических ограничений и подходит для прижизненной Двухфотонное микроскопии

Общая цель этой процедуры заключается в создании модели ортотопической глиобластомы, пригодной для прижизненной оптической визуализации в коре головного мозга мыши. Это достигается путем создания черепного окна над теменной корой. Следующим этапом процедуры является имплантация сфероидной опухоли глиобластомы S в поверхностные слои мозга.

Затем паренхима герметизирует датор и закупоривает инъекцию. Отслеживайте силы внутрипаренхиматозного развития опухоли и поддерживайте биофизические ограничения. Заключительным этапом является герметизация стеклянного окна, находящегося в тесном контакте с поверхностью мозга, чтобы предотвратить образование рубцовой ткани, тем самым обеспечивая оптимальную четкость во время визуализации.

В конечном счете, результаты могут показать прогрессирование опухоли глиобластомы, сосудистое ремоделирование и клеточное микроокружение с разрешением одной клетки с помощью прижизненной двухфотонной микроскопии. Впервые у нас возникла идея этого метода, когда мы пытались привить самосуспензию собственного стероида без физического барьера, чтобы избежать клеточного побега, и это приводило в основном к нефизиологическому, как in vitro, дополнительному росту. Этот метод может помочь в решении ключевых вопросов в области нейроонкологии, таких как роль ремоделирования сосудов и регуляторные эффекты клеточных взаимодействий во время бло.

Для имплантации стероида начните с легкого успокоения мыши в газовой камере, затем полностью обезболите мышь с помощью внутрибрюшинной инъекции кетамина с ксилазином. Проводите операцию в теплой комнате при температуре 26 градусов по Цельсию и держите мышь в тепле с помощью управляемой грелки. После нанесения глазных мазей и бритья кожи головы поместите мышь в стереотаксическую рамку с ушными планками и мундштуком с животным в нужном положении.

Очистите кожу 3%-ным мылом и 10%-ным раствором йода. Теперь с помощью ножниц сделайте разрез длиной в один сантиметр в продольном направлении посередине кожи головы. Срежьте и снимите кожу над теменными костями лезвием скальпеля, аккуратно удалите надкостницу над черепом.

Обильно нанесите цианоакрилаты поверх кости, чтобы создать шероховатую поверхность для последующего сцепления цемента. Теперь под хирургическим микроскопом с помощью лезвия скальпеля планируют просверлить теменную кость на расстоянии не менее миллиметра от черепа, швы, чтобы избежать кровоизлияний и окончательно удалить теменную кость над одним полушарием головного мозга во время сверления, добавить много ледяного PBS с пенициллином и стрептомицином для предотвращения перегрева. Костные фрагменты можно удалять с помощью щипцов и влажной марли каждую минуту или около того, а затем все можно удалить, когда сверление будет завершено.

Далее, затем кость на границе трепанации черепа, где будет запаиваться стеклянное окно. Сверлите до тех пор, пока кусок кости не будет слабо прикреплен, и, наконец, медленно долбите кость щипцами. В конечном счете, окно должно быть направлено против как можно большего количества мозговой ткани.

После того, как оконная рама будет готова, проверьте ее сухим спиртом очищенным пятимиллиметровым круглым стеклом на крышку стекла. При необходимости продолжайте долбление до тех пор, пока мозг не будет сжат с легким надавливанием на покровное стекло. Затем снова очистите крышку и отложите ее в сторону, чтобы открыть твердую мозговую оболочку.

Проделайте отверстие иглой 26 калибра в центре трепанации черепа, избегая кровеносных сосудов штата Мэн. Следите за тем, чтобы не повредить паренхиму головного мозга. Аккуратно очистите матру с помощью PBS, а затем накройте ее влажной папиросной бумагой, готовя сфероид.

Эта процедура требует предварительной подготовки системы впрыска S-сфероида и чашки Петри. Сначала отсасывайте круглый стероид, который подходит к внутреннему диаметру капилляра из чашки Петри. Стероид должен поступать вместе с примерно пятью микролитрами питательной среды, и он должен опускаться до кончика капилляра под собственным весом.

Снимите влажную папиросную бумагу, которой покрывали трепанацию черепа, и поместите животное под систему инъекций. Опустите пипетку для инъекций до тех пор, пока она не коснется отверстия, сделанного в твердой мозговой оболочке. Затем снова опустите его на 250 мкм и подождите 30 секунд.

Медленно вводите стероид с помощью поршня микролитрового шприца, два-три микролитра, одновременно впитывая лишнюю жидкость тонким кусочком папиросной бумаги. Подождите 30 секунд, а затем осторожно поднимите пипетку для инъекций на 50 микрон. Затем подождите еще 30 секунд, прежде чем поднимать еще 50 микрон.

Продолжайте повторять эту схему, чтобы довести пипетку до поверхности. Теперь подтвердите присутствие стероида в мозге с помощью флуоресцентного микроскопа в чашке Петри. Приготовьте вязкий раствор для пропитанных шариков диаметром от одного до 300 мкм.

Поперечные сшивки Dexter и гелевые шарики и PBS. Подождите минуту и перенесите часть гидратированных бусин в кость, прилегающую к краниотомии под микроскопическим контролем, выберите одну бусину с диаметром, аналогичным размеру диаметра отверстия. Разрежьте поперечные звенья DExT на две половины.

С помощью щипцов аккуратно введите сшитый декс и гелевый шарик геми в отверстие для инъекций выпуклой стороной по направлению к S-сфероиду. Осознавая хрупкость имплантата, осторожно надавливайте на бусину до тех пор, пока ее плоская поверхность не совпадет с твердой мозговой оболочкой. Далее нанесите каплю цианоакрилатного клея на предметное стекло и с помощью клея зубочистки запечатайте по краям нити бусины DExT.

Нанесите клей быстро и аккуратно, иначе бусина может прилипнуть к зубочистке. Не используйте слишком много клея, но достаточно, чтобы вызвать изменение пористости валика. Как показано здесь на образцах бусин, этот очень тонкий этап состоит целиком.

Приклейте валик к тер и окружающей паренхиме ровно настолько, чтобы не вызвать бугорок ягодиц, который в противном случае препятствовал бы размещению стеклянного окна и долгосрочной оптической прозрачности. Подождите две минуты, пока клей высохнет, а затем очистите трепанацию черепа в окружающей кости с помощью обычного PBS. Теперь расположите подготовленную крышку листом над местом трепанации черепа.

Края покровного стекла должны упираться в тонкий периметр черепа, а нижележащая твердая мозговая оболочка должна соприкасаться со стеклом, иначе рубцовая ткань может развиться и затруднить оптическую прозрачность с тканью. Рассосите PBS по краям крышки так, чтобы раствор не покрывал трепанацию черепа. При приложении небольшого давления в центре защитного стекла это гарантирует, что кость, стекло и мозг будут склеены вместе в интересующей области.

Поддерживайте легкое давление в центре покровного стекла с помощью щипцов, аккуратно нанося цианоакрилат на границе между костью и покровным листом, клей будет самопроизвольно растекаться до тех пор, пока не будет оттолкнут раствором PBS. В течение минуты образуется эффективная герметизация, но будьте предельно осторожны, чтобы не сдвинуть крышку, пока она не будет зафиксирована, иначе операция не удастся из-за утечки клея. Если клей растекся на верхней части стекла, удалите его с помощью лезвия микроскальпеля с помощью мягкого нажима и спиральных движений для поддержания оптической прозрачности.

Теперь закрепите фиксацию стекла, наложив стоматологические цементы на края крышки. Скользите к соседнему черепу. Покройте весь открытый череп до кожи головы с помощью дополнительного цемента.

Соорудите боковые стенки вокруг защитного стекла, чтобы можно было создать лужу раствора над стеклом. Для цели погружения имейте в виду, что стоматологические цементы затвердевают менее чем за 10 минут. Сняв мышь со стереотаксической рамки, уложите ее в клетку с теплым тканевым гнездом и приступайте к режиму послеоперационного ухода.

Рост опухоли ниже твердой мозговой оболочки можно наблюдать в течение нескольких недель после имплантации. Развитие этой опухоли было оценено с течением времени с помощью флуоресцентного микроскопа, сочетающего косое освещение для визуализации яркопольного отражения и порог эпифлуоресцентного излучения флуоресценции легко дает доступ к области опухоли, в то время как поверхностная сосудистая сеть отделяется в виде темных структур от белого фона изображения в видимом свете. С другой стороны, прижизненная двухфотонная микроскопия позволяет проводить Z-сечение и ортогональные реконструкции больших полей зрения с субклеточным разрешением, таких как дендриты.

Зеленым цветом показана экспрессия голубого флуоресцентного белка и нейронов, следующих за ростом опухоли с помощью двухфотонной микроскопии с 16-го по 27-й день. Некоторые кровеносные сосуды, выделенные стрелками, оставались стабильными в течение 11 дней, в то время как очерченный край опухоли сместился на 520 мкм, а сосудистая сеть опухоли изменилась по краям опухоли. Отделение клеток глиомы может быть видно из ядра опухоли, как и ожидалось от инвазивной опухоли.

Эти клетки выделяют цитоплазматические выступы и используют кровеносные сосуды в качестве матрицы для своего прогресса, на что указывают наконечники стрелок в паре с флуоресцентным репортером. Этот метод позволяет рассматривать такие физические взаимодействия между опухолевыми клетками и окружающей их средой как ключевые регуляторы прогрессирования заболевания. В неосвоенном виде этот метод может быть выполнен за 45 минут до одного часа, если он выполнен правильно после этой процедуры.

Другие методы доклинической визуализации, такие как флуоресцентная томография, рентген, компьютерная томография, МРТ, могут быть выполнены для того, чтобы ответить на дополнительные вопросы, такие как инфильтрация клеток необластомы в старый мозг.