С. elegans Анализ хемотаксиса
Движение клетки или организма в ответ на химический стимул называется хемотаксисом. В этом видео мы узнаем, как провести хемотаксис с использованием нематоды C. elegans. Мы также обсудим, как анализы хемотаксиса у C. elegans применяются для изучения обучения и памяти, обонятельной адаптации и болезни Альцгеймера.
Давайте сначала обсудим два разных типа хемотаксиса. Движение к химическому раздражителю называется положительным хемотаксисом. Напротив, движение в сторону от химического стимула называется негативным хемотаксисом, что позволяет организмам отходить от вредных химических веществ.
Хемотаксис может возникать на уровне организма, когда организмы движутся к источнику пищи. Хемотаксис также имеет место на клеточном уровне, в организмах. Например, иммунные клетки мигрируют к патогенам или местам воспаления. В другом примере сперматозоиды движутся к яйцеклетке в ответ на химиоаттрактант, выделяемый яйцеклеткой. Хемотаксис также является важным процессом в процессе развития, при котором клетки мигрируют в ответ на химический раздражитель, образуя ткани и органы в развивающемся организме.
Для диких, обитающих в почве C. elegans хемотаксис важен для обнаружения и продвижения к бактериям, их основному источнику пищи. Напротив, C. elegans отталкиваются тяжелыми металлами, веществами с низким pH и детергентами, которые токсичны для организма.
Анализ хемотаксиса обычно начинается с подготовки хемотаксис-планшетов. С помощью линейки и маркера разделите 5-сантиметровую пластину со средой для роста нематоды на четыре равных квадранта. Затем нарисуйте круг радиусом 0,5 см вокруг центра квадранта. Это и будет отправной точкой для червей. Отметьте и обозначьте точку в каждом квадранте таким образом, чтобы каждая точка была равноудалена от центра и друг от друга.
При подготовке червей к анализу очень важно использовать синхронизированных по возрасту молодых взрослых червей, чтобы различия в хемотаксисе не были артефактом стадии развития. После того, как черви синхронизируются, соберите их, сначала пипетируя 2 мл S-базального буфера на планшет с молодыми особями. Поворачивайте и наклоняйте посуду, чтобы смыть червей с тарелки.
Затем пипетируйте червячный/S-базальный раствор в микроцентрифужную пробирку. Промойте червей, кратковременно центрифугируя червячный/S-базальный раствор, удалив надосадочную жидкость и добавив еще один миллилитр S-базального раствора в гранулу червя. Переверните трубку и повторите промывку еще два раза. После промывки удалите весь S-базальный раствор, кроме примерно 100 μл. Затем добавьте 2 мкл смеси червя/S-базала в тарелку NGM. С помощью микроскопа подсчитайте количество присутствующих червей. В идеале на 2 мкл S-базала должно приходиться от 50 до 250 червей.
Теперь, когда хемотаксисные планшеты и черви готовы, мы можем приступить к анализу хемотаксиса. Сначала смешайте равные объемы испытуемого раствора с 0,5 М азидом натрия, анестетиком, который парализует червей, как только они достигнут места назначения. Проделайте то же самое с вашим решением для управления. Затем нанесите пипеткой 2 мкл червячно-базальной смеси на центр хемотаксисной пластины. Затем нанесите пипетку объемом 2 мкл испытуемого или контрольного раствора и поместите ее на соответствующим образом помеченные точки на хемотаксис-планшете. После того как тестовые и контрольные растворы впитаются, установите крышку обратно, переверните пластину и установите таймер на 1 час.
После того, как червям дали один час на то, чтобы отреагировать на химические раздражители на пластине, данные могут быть проанализированы. Вручную подсчитайте количество червей в каждом квадранте. Если червей привлекает исследуемое химическое вещество, в этих квадрантах будет присутствовать больше червей. Если они нейтральны по отношению к этому химическому веществу, черви будут присутствовать в каждом квадранте в равной степени.
Используйте эти данные для вычисления хемотаксического индекса, который представляет собой количество червей в тестовых квадрантах за вычетом числа червей в контрольном квадранте, деленное на общее количество червей. Хемотаксический индекс, близкий к +1, указывает на притяжение, в то время как хемотаксический индекс, близкий к -1, указывает на отталкивание.
Теперь, когда мы узнали, как настроить анализ хемотаксиса, давайте посмотрим, как эти эксперименты применяются для ответа на научные вопросы.
Одним из способов применения хемотаксиса у C. elegans является изучение обучения и памяти. Например, червей можно приучить ассоциировать химический стимул с источником пищи. Сытых червей морят голодом в течение одного часа, а затем их кондиционируют пищей, а также химическим веществом, таким как бутанон.
Далее черви держат на тарелке с едой, но без бутанона. Проведение анализа хемотаксиса затем определит, научились ли черви ассоциировать бутанон с пищей. Многие вариации этого эксперимента могут быть выполнены для определения другой информации, например, какие гены или нейроны важны для обучения и памяти.
Обонятельная адаптация — это явление, которое происходит, когда сенсорные нейроны со временем снижают свою реакцию на стимул, позволяя животному реагировать на другие, возможно, более важные стимулы. Например, дикий тип C. elegans, подвергшийся воздействию запаха в течение определенного периода времени, будет игнорировать этот запах во время анализа хемотаксиса из-за обонятельной адаптации, а не будет привлечен к нему. Таким образом, можно проводить высокопроизводительный генетический скрининг для выявления генетических регуляторов обонятельной адаптации, таких как egl-4. Кроме того, трансгенные черви, экспрессирующие флуоресцентно меченные белки, могут наблюдаться на предмет изменений локализации во время обонятельной адаптации.
Наконец, анализы хемотаксиса могут быть использованы у C. elegans для изучения болезни Альцгеймера. Ученые могут экспрессировать флуоресцентно помеченный бета-амилоидный пептид человека - отличительный признак болезни Альцгеймера - в нейронах C. elegans. Интересно, что анализы хемотаксиса показали, что черви, экспрессирующие бета-амилоид в популяции нейронов, демонстрируют сниженный хемотаксис по отношению к химиоаттрактанту по сравнению с контролем. Можно было бы провести множество вариаций этого эксперимента, включая экспрессию бета-амилоида в других популяциях нейронов или тканях, или определение того, могут ли какие-либо соединения смягчить эффекты экспрессии бета-амилоида, что в конечном итоге приведет к потенциальной терапии.
Вы только что посмотрели введение JoVE в хемотаксис у C. elegans. Во-первых, мы определили, что такое хемотаксис и почему он важен в природе для организмов и клеток. Затем мы продемонстрировали, как провести анализ хемотаксиса с C. elegans. Наконец, мы обсудили, как хемотаксис может быть применен для понимания обучения и памяти, обонятельной адаптации и болезни Альцгеймера. Спасибо за просмотр!
Хемотаксис — это процесс, при котором клетки или организмы перемещаются в ответ на химический раздражитель. В природе хемотаксис важен для того, чтобы…
Движение клетки или организма в ответ на химический стимул называется хемотаксисом. В этом видео мы узнаем, как провести хемотаксис с использованием нематоды C. elegans. Мы также обсудим, как анализы хемотаксиса у C. elegans применяются для изучения обучения и памяти, обонятельной адаптации и болезни Альцгеймера.
Давайте сначала обсудим два разных типа хемотаксиса. Движение к химическому раздражителю называется положительным хемотаксисом. Напротив, движение в сторону от химического стимула называется негативным хемотаксисом, что позволяет организмам отходить от вредных химических веществ.
Хемотаксис может возникать на уровне организма, когда организмы движутся к источнику пищи. Хемотаксис также имеет место на клеточном уровне, в организмах. Например, иммунные клетки мигрируют к патогенам или местам воспаления. В другом примере сперматозоиды движутся к яйцеклетке в ответ на химиоаттрактант, выделяемый яйцеклеткой. Хемотаксис также является важным процессом в процессе развития, при котором клетки мигрируют в ответ на химический раздражитель, образуя ткани и органы в развивающемся организме.
Для диких, обитающих в почве C. elegans хемотаксис важен для обнаружения и продвижения к бактериям, их основному источнику пищи. Напротив, C. elegans отталкиваются тяжелыми металлами, веществами с низким pH и детергентами, которые токсичны для организма.
Анализ хемотаксиса обычно начинается с подготовки хемотаксис-планшетов. С помощью линейки и маркера разделите 5-сантиметровую пластину со средой для роста нематоды на четыре равных квадранта. Затем нарисуйте круг радиусом 0,5 см вокруг центра квадранта. Это и будет отправной точкой для червей. Отметьте и обозначьте точку в каждом квадранте таким образом, чтобы каждая точка была равноудалена от центра и друг от друга.
При подготовке червей к анализу очень важно использовать синхронизированных по возрасту молодых взрослых червей, чтобы различия в хемотаксисе не были артефактом стадии развития. После того, как черви синхронизируются, соберите их, сначала пипетируя 2 мл S-базального буфера на планшет с молодыми особями. Поворачивайте и наклоняйте посуду, чтобы смыть червей с тарелки.
Затем пипетируйте червячный/S-базальный раствор в микроцентрифужную пробирку. Промойте червей, кратковременно центрифугируя червячный/S-базальный раствор, удалив надосадочную жидкость и добавив еще один миллилитр S-базального раствора в гранулу червя. Переверните трубку и повторите промывку еще два раза. После промывки удалите весь S-базальный раствор, кроме примерно 100 μл. Затем добавьте 2 мкл смеси червя/S-базала в тарелку NGM. С помощью микроскопа подсчитайте количество присутствующих червей. В идеале на 2 мкл S-базала должно приходиться от 50 до 250 червей.
Теперь, когда хемотаксисные планшеты и черви готовы, мы можем приступить к анализу хемотаксиса. Сначала смешайте равные объемы испытуемого раствора с 0,5 М азидом натрия, анестетиком, который парализует червей, как только они достигнут места назначения. Проделайте то же самое с вашим решением для управления. Затем нанесите пипеткой 2 мкл червячно-базальной смеси на центр хемотаксисной пластины. Затем нанесите пипетку объемом 2 мкл испытуемого или контрольного раствора и поместите ее на соответствующим образом помеченные точки на хемотаксис-планшете. После того как тестовые и контрольные растворы впитаются, установите крышку обратно, переверните пластину и установите таймер на 1 час.
После того, как червям дали один час на то, чтобы отреагировать на химические раздражители на пластине, данные могут быть проанализированы. Вручную подсчитайте количество червей в каждом квадранте. Если червей привлекает исследуемое химическое вещество, в этих квадрантах будет присутствовать больше червей. Если они нейтральны по отношению к этому химическому веществу, черви будут присутствовать в каждом квадранте в равной степени.
Используйте эти данные для вычисления хемотаксического индекса, который представляет собой количество червей в тестовых квадрантах за вычетом числа червей в контрольном квадранте, деленное на общее количество червей. Хемотаксический индекс, близкий к +1, указывает на притяжение, в то время как хемотаксический индекс, близкий к -1, указывает на отталкивание.
Теперь, когда мы узнали, как настроить анализ хемотаксиса, давайте посмотрим, как эти эксперименты применяются для ответа на научные вопросы.
Одним из способов применения хемотаксиса у C. elegans является изучение обучения и памяти. Например, червей можно приучить ассоциировать химический стимул с источником пищи. Сытых червей морят голодом в течение одного часа, а затем их кондиционируют пищей, а также химическим веществом, таким как бутанон.
Далее черви держат на тарелке с едой, но без бутанона. Проведение анализа хемотаксиса затем определит, научились ли черви ассоциировать бутанон с пищей. Многие вариации этого эксперимента могут быть выполнены для определения другой информации, например, какие гены или нейроны важны для обучения и памяти.
Обонятельная адаптация — это явление, которое происходит, когда сенсорные нейроны со временем снижают свою реакцию на стимул, позволяя животному реагировать на другие, возможно, более важные стимулы. Например, дикий тип C. elegans, подвергшийся воздействию запаха в течение определенного периода времени, будет игнорировать этот запах во время анализа хемотаксиса из-за обонятельной адаптации, а не будет привлечен к нему. Таким образом, можно проводить высокопроизводительный генетический скрининг для выявления генетических регуляторов обонятельной адаптации, таких как egl-4. Кроме того, трансгенные черви, экспрессирующие флуоресцентно меченные белки, могут наблюдаться на предмет изменений локализации во время обонятельной адаптации.
Наконец, анализы хемотаксиса могут быть использованы у C. elegans для изучения болезни Альцгеймера. Ученые могут экспрессировать флуоресцентно помеченный бета-амилоидный пептид человека - отличительный признак болезни Альцгеймера - в нейронах C. elegans. Интересно, что анализы хемотаксиса показали, что черви, экспрессирующие бета-амилоид в популяции нейронов, демонстрируют сниженный хемотаксис по отношению к химиоаттрактанту по сравнению с контролем. Можно было бы провести множество вариаций этого эксперимента, включая экспрессию бета-амилоида в других популяциях нейронов или тканях, или определение того, могут ли какие-либо соединения смягчить эффекты экспрессии бета-амилоида, что в конечном итоге приведет к потенциальной терапии.
Вы только что посмотрели введение JoVE в хемотаксис у C. elegans. Во-первых, мы определили, что такое хемотаксис и почему он важен в природе для организмов и клеток. Затем мы продемонстрировали, как провести анализ хемотаксиса с C. elegans. Наконец, мы обсудили, как хемотаксис может быть применен для понимания обучения и памяти, обонятельной адаптации и болезни Альцгеймера. Спасибо за просмотр!
Движение клетки или организма в ответ на химический стимул называется хемотаксисом. В этом видео мы узнаем, как провести хемотаксис с использованием нематоды C. elegans. Мы также обсудим, как анализы хемотаксиса у C. elegans применяются для изучения обучения и памяти, обонятельной адаптации и болезни Альцгеймера.
Давайте сначала обсудим два разных типа хемотаксиса. Движение к химическому раздражителю называется положительным хемотаксисом. Напротив, движение в сторону от химического стимула называется негативным хемотаксисом, что позволяет организмам отходить от вредных химических веществ.
Хемотаксис может возникать на уровне организма, когда организмы движутся к источнику пищи. Хемотаксис также имеет место на клеточном уровне, в организмах. Например, иммунные клетки мигрируют к патогенам или местам воспаления. В другом примере сперматозоиды движутся к яйцеклетке в ответ на химиоаттрактант, выделяемый яйцеклеткой. Хемотаксис также является важным процессом в процессе развития, при котором клетки мигрируют в ответ на химический раздражитель, образуя ткани и органы в развивающемся организме.
Для диких, обитающих в почве C. elegans хемотаксис важен для обнаружения и продвижения к бактериям, их основному источнику пищи. Напротив, C. elegans отталкиваются тяжелыми металлами, веществами с низким pH и детергентами, которые токсичны для организма.
Анализ хемотаксиса обычно начинается с подготовки хемотаксис-планшетов. С помощью линейки и маркера разделите 5-сантиметровую пластину со средой для роста нематоды на четыре равных квадранта. Затем нарисуйте круг радиусом 0,5 см вокруг центра квадранта. Это и будет отправной точкой для червей. Отметьте и обозначьте точку в каждом квадранте таким образом, чтобы каждая точка была равноудалена от центра и друг от друга.
При подготовке червей к анализу очень важно использовать синхронизированных по возрасту молодых взрослых червей, чтобы различия в хемотаксисе не были артефактом стадии развития. После того, как черви синхронизируются, соберите их, сначала пипетируя 2 мл S-базального буфера на планшет с молодыми особями. Поворачивайте и наклоняйте посуду, чтобы смыть червей с тарелки.
Затем пипетируйте червячный/S-базальный раствор в микроцентрифужную пробирку. Промойте червей, кратковременно центрифугируя червячный/S-базальный раствор, удалив надосадочную жидкость и добавив еще один миллилитр S-базального раствора в гранулу червя. Переверните трубку и повторите промывку еще два раза. После промывки удалите весь S-базальный раствор, кроме примерно 100 μл. Затем добавьте 2 мкл смеси червя/S-базала в тарелку NGM. С помощью микроскопа подсчитайте количество присутствующих червей. В идеале на 2 мкл S-базала должно приходиться от 50 до 250 червей.
Теперь, когда хемотаксисные планшеты и черви готовы, мы можем приступить к анализу хемотаксиса. Сначала смешайте равные объемы испытуемого раствора с 0,5 М азидом натрия, анестетиком, который парализует червей, как только они достигнут места назначения. Проделайте то же самое с вашим решением для управления. Затем нанесите пипеткой 2 мкл червячно-базальной смеси на центр хемотаксисной пластины. Затем нанесите пипетку объемом 2 мкл испытуемого или контрольного раствора и поместите ее на соответствующим образом помеченные точки на хемотаксис-планшете. После того как тестовые и контрольные растворы впитаются, установите крышку обратно, переверните пластину и установите таймер на 1 час.
После того, как червям дали один час на то, чтобы отреагировать на химические раздражители на пластине, данные могут быть проанализированы. Вручную подсчитайте количество червей в каждом квадранте. Если червей привлекает исследуемое химическое вещество, в этих квадрантах будет присутствовать больше червей. Если они нейтральны по отношению к этому химическому веществу, черви будут присутствовать в каждом квадранте в равной степени.
Используйте эти данные для вычисления хемотаксического индекса, который представляет собой количество червей в тестовых квадрантах за вычетом числа червей в контрольном квадранте, деленное на общее количество червей. Хемотаксический индекс, близкий к +1, указывает на притяжение, в то время как хемотаксический индекс, близкий к -1, указывает на отталкивание.
Теперь, когда мы узнали, как настроить анализ хемотаксиса, давайте посмотрим, как эти эксперименты применяются для ответа на научные вопросы.
Одним из способов применения хемотаксиса у C. elegans является изучение обучения и памяти. Например, червей можно приучить ассоциировать химический стимул с источником пищи. Сытых червей морят голодом в течение одного часа, а затем их кондиционируют пищей, а также химическим веществом, таким как бутанон.
Далее черви держат на тарелке с едой, но без бутанона. Проведение анализа хемотаксиса затем определит, научились ли черви ассоциировать бутанон с пищей. Многие вариации этого эксперимента могут быть выполнены для определения другой информации, например, какие гены или нейроны важны для обучения и памяти.
Обонятельная адаптация — это явление, которое происходит, когда сенсорные нейроны со временем снижают свою реакцию на стимул, позволяя животному реагировать на другие, возможно, более важные стимулы. Например, дикий тип C. elegans, подвергшийся воздействию запаха в течение определенного периода времени, будет игнорировать этот запах во время анализа хемотаксиса из-за обонятельной адаптации, а не будет привлечен к нему. Таким образом, можно проводить высокопроизводительный генетический скрининг для выявления генетических регуляторов обонятельной адаптации, таких как egl-4. Кроме того, трансгенные черви, экспрессирующие флуоресцентно меченные белки, могут наблюдаться на предмет изменений локализации во время обонятельной адаптации.
Наконец, анализы хемотаксиса могут быть использованы у C. elegans для изучения болезни Альцгеймера. Ученые могут экспрессировать флуоресцентно помеченный бета-амилоидный пептид человека - отличительный признак болезни Альцгеймера - в нейронах C. elegans. Интересно, что анализы хемотаксиса показали, что черви, экспрессирующие бета-амилоид в популяции нейронов, демонстрируют сниженный хемотаксис по отношению к химиоаттрактанту по сравнению с контролем. Можно было бы провести множество вариаций этого эксперимента, включая экспрессию бета-амилоида в других популяциях нейронов или тканях, или определение того, могут ли какие-либо соединения смягчить эффекты экспрессии бета-амилоида, что в конечном итоге приведет к потенциальной терапии.
Вы только что посмотрели введение JoVE в хемотаксис у C. elegans. Во-первых, мы определили, что такое хемотаксис и почему он важен в природе для организмов и клеток. Затем мы продемонстрировали, как провести анализ хемотаксиса с C. elegans. Наконец, мы обсудили, как хемотаксис может быть применен для понимания обучения и памяти, обонятельной адаптации и болезни Альцгеймера. Спасибо за просмотр!
View the full transcript and gain access to JoVE Science Education videos
Q1: What is the difference between positive and negative chemotaxis?
Positive chemotaxis is movement toward a chemical stimulus, while negative chemotaxis is movement away from it. Organisms use positive chemotaxis to move toward food sources or beneficial stimuli. Negative chemotaxis allows organisms to avoid harmful chemicals like heavy metals, acidic substances, or detergents that may be toxic.
Q2: Why is age synchronization important when preparing C. elegans for a chemotaxis assay?
Age synchronization ensures all worms are at the same developmental stage, preventing differences in chemotaxis behavior from being artifacts of development rather than true responses to chemical stimuli. Using young adult worms of uniform age provides consistent, reliable data for accurate experimental results and supports studies of development and reproduction caenorhabditis elegans.
Q3: How is the chemotactic index calculated and what do the values indicate?
The chemotactic index equals the number of worms in test quadrants minus worms in control quadrants, divided by total worms. A value close to +1 indicates strong attraction to the test chemical, while a value close to -1 indicates repulsion. Values near zero suggest the worms are neutral toward that chemical stimulus.
Q4: What role does sodium azide play in a C. elegans chemotaxis assay?
Sodium azide is an anesthetic mixed with test and control solutions at 0.5 M concentration. When worms reach their destination on the chemotaxis plate, sodium azide paralyzes them, allowing researchers to count their final positions accurately without worms continuing to move during data collection.
Q5: How can chemotaxis assays be used to study learning and memory in C. elegans?
Researchers condition starved worms by pairing a chemical stimulus like butanone with food. Worms are then placed on plates with food but without the chemical. A chemotaxis assay determines whether worms learned to associate the chemical with food, revealing genetic and neuronal mechanisms underlying learning and memory formation.
Q6: What is olfactory adaptation and how does it affect chemotaxis assay results?
Olfactory adaptation occurs when sensory neurons decrease their response to a stimulus over time, allowing animals to focus on other stimuli. Wild-type C. elegans exposed to an odor will ignore it during a chemotaxis assay due to olfactory adaptation rather than being attracted to it, enabling genetic screens to identify regulatory genes like egl-4.
Q7: How do chemotaxis assays help researchers study Alzheimer's disease using C. elegans?
Scientists express fluorescently tagged human amyloid beta peptide, a hallmark of Alzheimer's disease, in C. elegans neurons. Chemotaxis assays reveal that worms expressing amyloid beta show reduced chemotaxis toward chemo-attractants compared to controls, providing insights into how the disease affects neural function and potential therapeutic interventions.
Chapters in this video
0:00
Introduction to Nematode Chemotaxis
0:38
Chemotaxis: The Concept.
2:03
Preparing for a C. elegans Chemotaxis Assay
3:56
Running the Chemotaxis Assay
4:49
Analyzing Chemotaxis Data
5:41
Applications
8:18
Summary
Videos from this collection: