Анализ хемотаксиса C. elegans

Перемещение клетки или организма в ответ на химический стимул представляет собой поведение, называемое хемотаксисом. В этом видео мы изучим, как проводить анализ хемотаксиса с использованием нематоды C. elegans. Мы также обсудим, как анализы хемотаксиса у C. elegans применяются для изучения обучения и памяти, ольфакторной адаптации и болезни Альцгеймера.

Для начала рассмотрим два различных типа хемотаксиса. Движение по направлению к химическому стимулу называется положительным хемотаксисом. Напротив, движение в сторону от химического стимула называется отрицательным хемотаксисом, что позволяет организмам удаляться от вредных химических веществ.

Хемотаксис может происходить на уровне организма, когда особи перемещаются к источнику пищи. Хемотаксис также осуществляется на клеточном уровне внутри организма. Например, иммунные клетки мигрируют к патогенам или в очаги воспаления. В другом примере сперматозоиды движутся к яйцеклетке в ответ на хемоаттрактант, выделяемый ею. Хемотаксис также является важным процессом в ходе развития, при котором клетки мигрируют в ответ на химический стимул, формируя ткани и органы развивающегося организма.

Для диких почвенных C. elegans хемотаксис важен для обнаружения и перемещения к бактериям, которые являются их основным источником пищи. В противоположность этому, C. elegans отталкиваются от тяжелых металлов, веществ с низким pH и детергентов, которые токсичны для организма.

Анализы хемотаксиса обычно начинаются с подготовки чашек для хемотаксиса. С помощью линейки и маркера разделите чашку диаметром 5 см с питательной средой для нематод (NGM) на четыре равных квадранта. Затем нарисуйте круг радиусом 0,5 см вокруг центра каждого квадранта. Это будет точка старта для червей. Отметьте и подпишите точку в каждом квадранте так, чтобы каждая точка была равноудалена от центра и друг от друга.

При подготовке червей к анализу критически важно использовать синхронизированных по возрасту молодых взрослых особей, чтобы различия в хемотаксисе не были артефактом стадии развития. После синхронизации червей соберите, сначала пипетируя 2 ml буфера S-basal на чашку с молодыми взрослыми особями. Вращайте и наклоняйте чашку, чтобы смыть червей с поверхности.

Затем перенесите суспензию червей в буфере S-basal в микроцентрифужную пробирку. Промойте червей, кратковременно центрифугируя суспензию, удаляя супернатант и добавляя еще один миллилитр раствора S-basal к осадку червей. Переверните пробирку и повторите промывку еще два раза. После промывки удалите весь раствор S-basal, оставив примерно 100 μl. Затем перенесите 2 μl смеси червей в S-basal на чашку с NGM. С помощью микроскопа подсчитайте количество имеющихся червей. В идеале должно быть от 50–250 червей на 2 μl S-basal.

Теперь, когда планшеты для хемотаксиса и черви готовы, можно приступить к проведению анализа хемотаксиса. Сначала смешайте равные объемы вашего тестового раствора с 0,5 M азидом натрия — анестетиком, который парализует червей после достижения ими конечной точки. Повторите то же самое с контрольным раствором. Затем нанесите пипеткой 2 μl смеси червей и среды S-basal в центр планшета для хемотаксиса. После этого нанесите пипеткой 2 μl тестового или контрольного раствора в соответствующие помеченные точки на планшете. Как только тестовые и контрольные растворы будут поглощены, закройте планшет крышкой, переверните его и установите таймер на 1 час.

После того как червям будет предоставлен один час для реакции на химические стимулы на планшете, можно приступить к анализу данных. Вручную подсчитайте количество червей в каждом квадранте. Если химическое вещество вызывает у червей притяжение, в соответствующих квадрантах будет находиться больше особей. Если вещество нейтрально, черви будут распределены по квадрантам поровну.

Используйте эти данные для расчета индекса хемотаксиса, который представляет собой разность между количеством червей в тестовых квадрантах и количеством червей в контрольном квадранте, деленную на общее число червей. Значение индекса хемотаксиса, близкое к +1, свидетельствует о притяжении, тогда как значение, близкое к -1, указывает на отталкивание.

Теперь, когда мы изучили основы постановки анализа хемотаксиса, давайте рассмотрим, как эти эксперименты применяются для поиска ответов на научные вопросы.

Один из способов проведения анализов на хемотаксис в C. elegans были применены для изучения обучения и памяти. Например, червей можно приучить ассоциировать химический стимул с источником пищи. Сытых червей подвергают голоданию в течение одного часа, после чего проводят кондиционирование с использованием пищи и химического вещества, такого как бутанон.

Затем червей помещают на чашку с кормом, но без бутанона. Последующее проведение анализа хемотаксиса позволит определить, научились ли черви ассоциировать бутанон с пищей. Для получения других данных, например, о том, какие гены или нейроны имеют значение для обучения и памяти, можно провести множество вариаций данного эксперимента.

Ольфакторная адаптация — это феномен, при котором сенсорные нейроны со временем снижают свою реакцию на стимул, что позволяет животному реагировать на другие, возможно, более важные стимулы. Например, особи дикого типа C. elegans При воздействии запаха в течение определенного времени животные будут игнорировать этот запах во время анализа хемотаксиса из-за ольфакторной адаптации, а не проявлять к нему влечение. Следовательно, можно проводить высокопроизводительный генетический скрининг для выявления генетических регуляторов ольфакторной адаптации, таких как egl-4. Кроме того, на трансгенных червях, экспрессирующих белки с флуоресцентными метками, можно наблюдать за изменениями их локализации в процессе ольфакторной адаптации.

Наконец, анализы на хемотаксис могут быть использованы при C. elegans для изучения болезни Альцгеймера. Ученые могут экспрессировать в нейронах C. elegans человеческий амилоид-бета-пептид с флуоресцентной меткой, который является характерным признаком болезни Альцгеймера. Примечательно, что тесты на хемотаксис показали, что черви, экспрессирующие амилоид-бета в определенной популяции нейронов, демонстрируют сниженный хемотаксис по отношению к хемоаттрактанту по сравнению с контрольной группой. Можно провести множество вариаций этого эксперимента, включая экспрессию амилоида-бета в других популяциях нейронов или тканях, а также определение того, могут ли какие-либо соединения смягчить эффекты экспрессии амилоида-бета, что в конечном итоге может привести к созданию потенциального метода терапии.

Вы только что посмотрели вводное видео JoVE о хемотаксисе у C. elegans. Сначала мы определили, что такое хемотаксис и почему он важен в природе для организмов и клеток. Затем мы продемонстрировали, как проводить анализ хемотаксиса с использованием C. elegans. В завершение мы обсудили, как хемотаксис может быть использован для изучения обучения и памяти, обонятельной адаптации и болезни Альцгеймера. Спасибо за просмотр!