Высоко Решено Прижизненные Полосатый-подсветка микроскопия зародышевых центров

Общая цель данной процедуры — подготовить стандартный двухфотонный микроскоп для получения intravital-изображений высокого разрешения. Это достигается путем предварительной юстировки микроскопа, включая настройку лазеров. Затем выполняется юстировка мультиплексора луча для достижения идеальной формы луча и правильного расположения освещенной области.

В случае многолучевого сканирования исходные изображения получают путем сканирования образца с использованием полосчатого паттерна освещения. На заключительном этапе применяется алгоритм для расчета итогового изображения высокого разрешения. В конечном итоге микроскопия с полосчатым освещением используется для демонстрации деталей поведения иммунной системы в герминативных центрах лимфатических узлов мышей, которые ранее были недоступны для intravital-микроскопии.

Главным преимуществом данного метода по сравнению с существующими подходами, такими как микроскопия со структурированным освещением или локализационная микроскопия, является возможность его применения на большой глубине тканей в живых образцах. Он не требует модификации формы лазерного луча, что делает метод очень простым и легким в реализации для любого многофотонного микроскопа. Здесь представлена установка для двухфотонной микроскопии с многолучевым полосатым освещением, предназначенная для достижения оптимального разрешения и качества контраста при минимальном уровне фотообесцвечивания и максимальной скорости сбора данных.

Рассмотрите возможность внесения корректировок в установку, как описано в текстовом протоколе. После внесения корректировок убедитесь, что луч возвращается на зеркало, расположенное непосредственно над входным зеркалом в конце компрессора импульсов на основе призм. После настройки пути света от этой точки луч отражается в мультиплексор пучка.

При выполнении многолучевого полосчатого освещения в режиме многофотонной микроскопии с выключенным сканером выровняйте зеркала в мультиплексоре лучей, поместив на предметный столик образец с однородной флуоресценцией и сфокусировав лазерный луч внутри образца, но близко к его верхней поверхности, рядом с передней линзой объектива.

Переведите микроскоп в многолучевой режим, выберите количество лучей и поляризацию. Например, чтобы найти лазерный луч P, визуализировав флуоресцентный предметный стекле, откройте затвор P и работайте с CCD-камерой в непрерывном режиме при фокусировке луча, добиваясь его центрирования. При юстировке луча P переключитесь в режим 64 лучей и откройте соответствующий затвор.

Проверьте положение луча. Отрегулируйте зеркала мультиплексора первого — пятого лучей, чтобы убедиться, что световые пятна лучей расположены на равном расстоянии. Поскольку алгоритмы полосчатого освещения основаны на этом допущении, замените равномерно флуоресцирующий образец на образец с неоднородной структурой.

Например, возьмите образец корня из области Conval и проведите многолучевое сканирование. Убедитесь, что изображение четкое, равномерное и прямое. Замените гетерогенный образец на гомогенный.

Запустите XY-сканер для управления процессом сканирования. Для создания полосатого паттерна возбуждения при многолучевом сканировании перемещайте зеркало Y-сканера перпендикулярно линии освещения лучом.

Повторите здесь сгенерированный паттерн, указав количество блоков путем перемещения зеркала сканера по оси X (так называемый сдвиг блоков), чтобы создать прямоугольное полосчатое изображение. Верните гетерогенный образец на место и используйте сканер в качестве главного триггера. Синхронизируйте камеру со сканером для автоматического получения и сохранения полосчатого изображения с целью многократного сбора таких изображений.

Переместите зеркало сканера по оси X в различные положения, выбрав достаточное количество шагов повторения здесь, число сдвигов и соответствующую длину шага здесь. Шаг сдвига между двумя последовательными полосчатыми изображениями должен перекрывать расстояние между двумя последовательными ширинами пучка. Установите значение сдвига по X ниже предела латерального разрешения для данной длины волны возбуждения.

Например, использование 10 шагов зеркала сканера по оси X за один сдвиг и 12 или 13 сдвигов обеспечивает наилучшее пространственное разрешение. Результаты по корневому срезу области конвалесценции позволяют оптимизировать эти два значения до тех пор, пока изображение области конвалесценции не станет максимально четким. Используйте инструмент профиля линии (line profile tool) для анализа обычных CCD-изображений и рассчитанных изображений с полосчатым освещением.

Сравните ширину профилей линий, которые в данном примере представляют собой флуоресцентный сигнал от клеточных стенок. Получайте каждое исходное изображение с полосчатым освещением синхронно с движением сканера и сохраняйте их отдельно, например, в файлы TIFF или бинарные файлы. Для создания двумерной матрицы изображения с полосчатым освещением высокого разрешения откройте полный набор исходных полосчатых изображений в качестве матриц в процедуре анализа.

Для проведения многофотонной микроскопии в глубоких тканях с использованием полосaтого освещения и многолучевой системы применяйте либо алгоритм минимального максимума, либо алгоритм на основе преобразования Фурье, подробно описанные ранее. В живых организмах получайте изображения с полосaтым освещением на разной глубине тканей в течение определенного времени и оценивайте их согласно ранее описанному методу, чтобы создать 3D-видео высокого разрешения, демонстрирующее динамическое взаимодействие между герминативным центром, B-клетками и фолликулярными дендритными клетками. Размеры эффективной функции рассеяния точки соответствуют пространственному разрешению микроскопа.

Мы измерили эту трехмерную функцию, регистрируя либо сигнал генерации второй гармоники коллагеновых волокон, либо флуоресцентный сигнал полистироловых микросфер размером 100 nanometer с эмиссией на 515 nanometers в лимфатических узлах мыши. Мы использовали разработанный нами метод T-P-L-S-M с многолучевым полосчатым освещением в сравнении с общепринятыми методами двухфотонной лазерной сканирующей микроскопии, такими как T-P-L-S-M с детектированием поля с помощью CCD-камер и T-P-L-S-M с точечным детектированием. Эти измерения наглядно показывают, что на поверхности образца значения как латерального, так и аксиального разрешения соответствуют ожидаемым величинам, предсказанным теорией дифракции.

Однако с увеличением глубины визуализации и, следовательно, с увеличением оптического пути как возбуждающего, так и эмиссионного излучения через среду с сильно варьирующимися показателями преломления, пространственное разрешение значительно ухудшается независимо от используемой установки. Применяя M-B-S-I-T-P-L-S-M независимо от глубины визуализации, мы достигли примерно на 20% лучшего латерального разрешения и на 220% лучшего аксиального разрешения по сравнению со стандартными методами T-P-L-S-M.

Клональный отбор B-клеток в ходе иммунного ответа во вторичных лимфоидных органах взрослых мышей является первым этапом их дифференцировки в B-клетки памяти или плазматические клетки. Считается, что центральную роль в этом процессе играет высокодинамичное взаимодействие между фолликулярными дендритными клетками и B-клетками на уровне структур иммунных комплексов внутри герминативных центров. Только с помощью технологии intravital микроскопии с высоким разрешением можно детально изучить эту клеточную коммуникацию и ее влияние на иммунный ответ, что продемонстрировано здесь с помощью маркировки фолликулярных дендритных клеток анти-CD 21 35 FAB ATO five 90.

Метод M-B-S-I-T-P-L-S-M впервые предоставляет возможность визуализировать и количественно оценивать размеры кластеров депозитов иммунных комплексов in vivo на глубине до 120 микрон в герминативных центрах паппальных лимфоузлов. На этих изображениях представлено прямое сравнение трехмерных флуоресцентных изображений депозитов иммунных комплексов в герминативном центре, полученных с помощью традиционного метода на основе ФЭУ и метода M-B-S-I-T-P-L-S-M. Более того, взаимодействия депозитов иммунных комплексов с B-клетками герминативного центра могут быть детально визуализированы и теперь могут исследоваться в сочетании с функциональными зондами in vivo для анализа пролиферации, дифференцировки или апоптоза.

При выполнении данной процедуры важно помнить, что при использовании метода детектирования с помощью камеры скорость сбора данных примерно в восемь раз выше, в то время как максимальная глубина визуализации примерно на 25% меньше, чем при использовании стандартного многофотонного микроскопа на основе фотоумножителя. После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как настроить ваш многофотонный микроскоп для работы методом полосчатого освещения, включая регулировку оптического пути микроскопа, юстировку световых ловушек, расчет параметров сканирования и способы получения итогового изображения высокого разрешения для экспериментов на глубоких тканях in vivo.