Ультразвуковое исследование наведением Внутрисердечный впрыска по разработке модели мышей от рака молочной железы Метастазы в головной мозг с последующим продольного МРТ

Общая цель данной процедуры заключается в использовании ультразвукового наведения для создания мышиной модели метастазов рака молочной железы в головном мозге с последующим мониторингом с помощью МРТ. Это достигается путем сбора мозготропных клеток рака молочной железы и их введения в левый желудочек. Затем под контролем ультразвука осуществляется мониторинг развития внутричерепной опухоли.

С помощью МРТ и подтверждения метастазов путем окрашивания гематоксилином и эозином. В конечном итоге точная инъекция под визуальным контролем может значительно повысить эффективность мониторинга формирования и развития метастазов рака молочной железы в головном мозге. Лонгитюдная МРТ позволяет осуществлять неинвазивный мониторинг формирования и развития рака молочной железы.

Все процедуры с животными были одобрены Институциональным комитетом по уходу и использованию животных Медицинского центра Юго-Западного университета Техаса. Для данного протокола подготовьте клетки M-D-A-M-B 2 31 B-R-G-F-P, культивируемые в среде DMEM, содержащей 10% FBS, 1% глутамина и 1% пенициллина-стрептомицина. Постоянно контролируйте состояние клеток и заменяйте среду каждые два-три дня. При достижении 80% конфлюэнтности обработайте клетки трипсином и соберите их.

Сначала полностью удалите старую среду с помощью вакуумной пипетки. Затем добавьте пять миллилитров PBS, чтобы осторожно промыть клетки, пока все они не будут покрыты PBS. После этого удалите промывочный раствор.

Затем добавьте в чашку 1.5 milliliters трипсина. Осторожно наклоните чашку, чтобы весь слой клеток был покрыт трипсином. Поместите чашку обратно в инкубатор для клеток при температуре 37 °C.

Подождите одну минуту и осмотрите клетки под микроскопом. Если они стали округлыми и свободно плавают, значит, они открепились. Добавьте три миллилитра среды, чтобы остановить процесс переваривания, и перенесите смесь клеток пипеткой в центрифужную пробирку.

Центрифугируйте смесь при 1,160 G в течение пяти минут. Затем осторожно удалите среду с помощью вакуумной пипетки. После этого аккуратно ресуспендируйте клетки в пяти миллилитрах среды без сыворотки с помощью пипетки до полного исчезновения видимого осадка клеток и достижения гомогенности раствора, от которого затем следует отобрать 50 µL клеточной смеси.

После тщательного перемешивания добавьте 50 µL трипанового синего. Перенесите по 10 µL в несколько камер для подсчета клеток. Затем подсчитайте количество клеток, используя значения счетчика клеток.

Вычислите и используйте среднее значение всех подсчетов. Теперь приготовьте более точную суспензию клеток. Повторно центрифугируйте их и ресуспендируйте в концентрации 175 000 клеток на 100 µL безсывороточной среды.

Затем поместите клетки на лед для проведения внутрисердечной инъекции. В данном протоколе используйте самок мышей линии BC nude в возрасте от шести до восьми недель. Войдите в систему визуализации и инициализируйте датчик.

7 0 4 на частоте 40 мегагерц. Начните новое исследование и заполните соответствующие поля с информацией. Затем проведите анестезию мыши, подавая анестетик через носовой конус.

При проведении инъекции под контролем визуализации установите температуру стола для визуализации на 37 °C и закрепите мышь на столе скотчем в положении на спине. Перед началом визуализации подогрейте ультразвуковой гель до 37 °C и нанесите его на грудную клетку мыши. Затем установите датчик в держатель и опустите его до требуемой глубины визуализации.

Затем перемещайте предметный столик до тех пор, пока не будет идентифицирован левый желудочек, используя восходящую аорту в качестве ориентира; зафиксируйте столик в положении с наиболее четким изображением. Теперь наберите 100 µL охлажденной смеси клеток в шприц объемом 1 мл с иглой 22G. Закрепите заполненный шприц в держателе для шприца.

Затем переместите шприц к грудной клетке. Перед введением в тело мыши осторожно перемещайте его из стороны в сторону, пока кончик иглы не окажется в поле зрения системы визуализации. Отрегулируйте высоту и угол наклона иглы для попадания в левый желудочек, а затем, когда игла окажется в нужном положении, быстро проведите ее через слои кожи и мышц в левый желудочек.

Под контролем ультразвукового изображения признаком успешного введения иглы в левый желудочек является рефлюкс ярко-розовой артериальной крови в шприц. Затем медленно введите клеточную смесь, извлеките иглу, поднимите датчик и удалите ультразвуковой гель влажной марлей. После этого освободите животное от фиксирующей ленты и перенесите его в чистую клетку с предварительно нагретой подстилкой.

Наблюдайте за мышью до ее полного восстановления, после чего в течение нескольких дней проводите ежедневный осмотр. При использовании разрешения 78 квадратных микрон в плоскости на МРТ можно идентифицировать гиперинтенсивные очаги диаметром 310 микрон. Поскольку метастазы в данном исследовании были очень маленькими, а некроз и отек были минимальными, гиперинтенсивный очаг на T2-взвешенных изображениях действительно соответствовал опухоли.

Массовые лонгитюдные исследования МРТ позволяют проводить неинвазисную оценку роста опухоли in vivo. МРТ с высоким разрешением позволила обнаружить несколько небольших очагов через три недели после внутрисердечной инъекции; на четвертой неделе все очаги, наблюдавшиеся при предыдущем сканировании, увеличились в размере. На Т2-взвешенных изображениях появилось больше новых очагов.

Окрашивание гематоксилином и эозином выявило диффузные метастатические очаги или же окрашивание гематоксилином и эозином выявило метастатические очаги кластерного типа. Вокруг опухоли часто наблюдались расширенные сосуды, что указывало на протекание неспорутового ангиогенеза. После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как выполнять инъекцию иглой под контролем ультразвукового исследования в левый желудочек сердца мыши.