Самый быстрый Западная в городе: современный поворот на анализ Классический вестерн-блоттинга

Общая цель этой процедуры состоит в том, чтобы определить ключевые усовершенствования классической техники вестерн-блоттинга для получения лучшего разрешения, качества, чувствительности и точности западных данных. Сначала это достигается путем подготовки образцов с буфером, содержащим сульфат лития ESAL, чтобы обеспечить оптимальные условия для восстановления белка и алкилирования при сохранении целостности белка. Второй шаг заключается в разделении белков с помощью гелевой системы BIS tris, которая завершает электрофорез за 35 минут.

Далее с помощью системы сухого блоттинга используется система сухой блоттинга для переноса белков на мембрану за семь минут. Последним шагом является обнаружение белков с помощью инфракрасной флуоресцентной визуализации, которая использует красители ближнего инфракрасного диапазона в двух разных флуоресцентных каналах для одновременной визуализации двух разных антигенов на одной и той же мембране. В конечном счете, эти новые модификации традиционного метода вестерн-блоттинга приводят к получению более точных качественных и количественных данных, при этом значительно сокращая время выполнения этого метода.

Основными преимуществами данной методики по сравнению с существующими западными методами блоттинга является повышенная эффективность, согласованность и чувствительность западных данных, что позволяет проводить точную количественную оценку нескольких белков-мишеней на одной и той же мембране, при этом значительно сокращая экспериментальное время выполнения данной методики. Для начала поместите 15 миллилитровые конические пробирки и рядом с текучими 10-сантиметровыми квадратными посудами для клеточных культур на льду. Затем добавьте пять миллилитров ледяного PBS, содержащего пять миллимолярных ЭДТА, в каждую чашку с помощью скребка для клеток.

Удалите адгезивные клетки из чашки и переложите клеточные суспензии в одну из предварительно охлажденных конических пробирок объемом 15 миллилитров. Затем гранулируйте клеточные суспензии при температуре четыре градуса Цельсия методом центрифугирования на низкой скорости при 230 GS в течение пяти минут. Закончив, поместите конические трубки на лед и осторожно отсасывайте надосадочную жидкость, не повреждая клеточную гранулу.

Промойте гранулы одним миллилитром охлажденного PBS, содержащего пять миллимоляров ЭДТА, и переложите клеточные суспензии в холодную центрифужную пробирку объемом 1,5 миллилитров. Затем гранулируйте клетки, вращая суспензию при температуре около 13 000 G в течение 10 секунд. После центрифугирования осторожно удалите надосадочную жидкость S, не нарушая гранулу, и поместите пробирки на лед.

Затем добавьте свежие ингибиторы протеазы и фосфата в двухкратной конечной концентрации в буфер Ripa. Затем ресуспендируйте клетки в концентрации 20 миллионов клеток на миллилитр в буфере Rippa. Кратковременно перебейте каждую трубку и инкубируйте суспензию в течение 20-30 минут на льду.

Создайте пронуклеарную фракцию путем центрифугирования лизатов при температуре около 15 000 G в течение пяти минут. При температуре четыре градуса Цельсия перенесите SNAT в новую трубку и поместите новые трубки на лед. На этом этапе обогащенные ядерными веществами гранулы могут быть выброшены.

Затем определите концентрацию белка в каждом образце с помощью BCA. Подготовьте образцы для электрофореза, используя пропорции, указанные здесь. Общий объем учитывает вариации пипетирования, при этом на лунку загружается 20 микролитров каждого образца.

Далее нагрейте образцы до 70 градусов Цельсия в течение 10 минут. Пока образцы нагреваются, приготовьте один литр одного рабочего буфера XMES. Как только образцы будут готовы, нагрев, быстро раскрутите образцы и поместите их на лед.

Затем подготовьте сборные гели bis tress в мини-ячейке для электрофореза. Снимите гребень с сборных гелей и сориентируйте гель так, чтобы более короткая кассета каждого геля была обращена внутрь к буферному ядру. Убедитесь, что гели выровнены и плотно прижаты к сердцевине буфера.

Чтобы избежать сцепления с верхней буферной камерой, заполните верхнюю буферную камеру 200 миллилитрами одного рабочего буфера XMES, содержащего точку 25% антиоксиданта, а затем нижнюю буферную камеру мини-ячейки примерно 600 миллилитров одного рабочего буфера XMES, загрузите от двух до пяти микролитров соответствующей лестницы во внешние лунки. А затем по 20 микролитров каждого образца белка в центральные лунки. Затем запустите гели при постоянном напряжении 200 вольт в течение 35 минут. Следите за выходным напряжением, чтобы узнать ожидаемый ток от 110 до 125 миллиампер на гель в начале и от 70 до 80 миллиампер на гель в конце.

Чтобы начать перенос белка, полностью отделите мини-гели, разорвав скрепленные стенки кассеты. Выбросьте более короткую пластину и осторожно переложите гель с более длинной щелевой пластины в емкость с деионизированной водой. Затем удалите толстую часть геля на ножке, расположенную на дне.

В редких случаях гель может прикреплять более короткую пластину вместо более длинной щелевой пластины. В этом случае выбросьте более длинную щелевую пластину и удалите толстую часть геля, расположенную внизу. Затем аккуратно переложите гель с более короткой пластины.

Затем соберите передаточные стеки в соответствии с инструкциями производителя на устройстве для сухой промокательной обработки. Осторожно удалите пузырьки или воздух, застрявшие между гелем и мембраной, чтобы предотвратить деформацию белковой полосы во время переноса. Затем выберите подходящую программу перевода и начните перевод.

Это может занять от семи до 10 минут в зависимости от размера переносимого белка. Подготовьте мембрану для обнаружения инфракрасного флуоресцентного белка, заблокировав мембрану минимум в 0,8 мл на квадратный сантиметр буфера, блокирующего одиссею, на один час или на ночь при температуре четыре градуса Цельсия перед инкубацией мембраны в первичное антитело. Мембрана может быть разделена на различные части для зондирования нескольких антител на одной и той же мембране.

Затем инкубируют мембрану в первичном антителе, разведенном в буфере, блокирующем одиссею, с добавлением 0,1% при температуре 20 в течение ночи при четырех градусах Цельсия, чтобы визуализировать два разных антигена на одной и той же партии, оба антитела должны быть получены от разных видов хозяина после инкубации с первичным антителом. Промойте мембрану три раза в TBS с 0,1%tween 20 в течение 10 минут, осторожно встряхивая. Затем добавьте флуоресцентно меченные вторичные антитела, разведенные в буфере, блокирующем одиссею, с 0,1% tween 20.

Обратите внимание, что вторичные антитела должны быть получены из того же вида хозяина, что и каждое из первичных антител, и помечены различными Fluor 4 Инкубируйте мембрану в легком защищенном контейнере в течение 30-60 минут. Инкубация мембраны в течение более чем одного часа может увеличить фоновую промывку мембраны три раза в течение 10 минут в TBS плюс 0,1% от 20, при этом мембрана защищена от света с легким встряхиванием, мембрана может быть высушена или храниться в TBS или PBS без tween 20 при четырех градусах Цельсия до тех пор, пока она не будет отсканирована и визуализирована с помощью инфракрасной системы визуализации. Флуоресцентный сигнал будет оставаться стабильным в течение нескольких месяцев при правильной защите от света.

Этот вестерн-блот показывает одновременное обнаружение полной дуги 1 и 2 в 800-нанометровом зеленом канале и бета-актина в 700-метровом красном канале из лизатов WM 7 93, белка меланомы, полученного от человека. Одноканальное флуоресцентное детектирование на второй панели показывает BIM с той же мембраны. Двухцветная инфракрасная система также может создавать черно-белые изображения, как видно на трех панелях ниже: количественная оценка полос общего инфракрасного излучения, одного из двух бета-актина и общего BIM была получена из интегрированной интенсивности каждой полосы белка.

Интегральная интенсивность пропорциональна количеству флуоресцентно меченных вторичных антител на мембране. Значения R-квадрат использовались для оценки линейной регрессии для каждого анализируемого антитела. WM 7 93 клетки меланомы обрабатывали ингибитором ДМСО или MEK в течение 18 часов.

Двухцветное флуоресцентное детектирование вестерн-блоттинга показывает фосфо или один, два в зеленом канале 800 нанометров, а общий IRC один, два в красном канале 700 с перекрывающимися сигналами фосфо irk и общим irk в желтом цвете. Добавление ингибитора меха приводит к потере экспрессии фосфо irk one two, но не влияет на общую экспрессию IRC one two. На графике справа показана количественная оценка фосфо IRC один два нормализованных до общего IRC один два уровня белка из рисунка слева.

Это было рассчитано с использованием интегральной интенсивности флуоресцентного сигнала, и данные представлены в процентах от контроля ДМСО. После просмотра этого видео у вас должно быть хорошее понимание того, как использовать последние инновационные достижения и выполнять вестерн-блоттинг, который значительно сократит время эксперимента и даст более качественные и количественные данные.