Методология эффективного поколения флуоресцентно помеченных вирусных белков Vaccinia

В данном эксперименте создаются рекомбинантные вирусы вакцины с флуоресцентной меткой с помощью модульного и экспресс-метода, основанного на транзиторном доминантомном отборе. Сначала создается рекомбинантный вектор, содержащий флуоресцентную метку, окруженную синтезированными минимальными областями гомологии, а также маркеры для метаболического и флуоресцентного отбора. Этот рекомбинационный вектор трансфицируют в инфицированные клетки и амплифицируют рекомбинантные вирусы, используя метаболический отбор и флуоресценцию. Затем метаболический отбор отменяют, чтобы вырезать маркерную кассету, и изолируют клетки, содержащие рекомбинантные вирусы, путем отбора по флуоресцентному маркеру. Результаты анализа вирусных бляшек на монослоях клеток позволяют визуализировать отдельные вирусные частицы, несущие флуоресцентно меченный ген.

Мы разработали этот метод, так как стремились создавать рекомбинантные вирусы с множественными генетическими модификациями, используя метод селекции, который можно было бы применять многократно и универсально, независимо от используемой метки. Хотя принцип транзиентной доминантной селекции был описан ранее, мы хотели применить его в более широком масштабе и модульным образом, чтобы обеспечить большую гибкость при внесении геномных модификаций. Визуальная демонстрация этого метода имеет решающее значение, поскольку скрининг и изоляция рекомбинантных вирусных бляшек могут быть затруднены. Частота их появления может быть низкой, и поэтому для эффективного выделения вируса требуются особые методы.

Пометьте интересующий вирусный ген на N- или C-конце белка. Соответственно, определите фланкирующие области гомологии длиной 150 пар оснований. Затем разработайте последовательность олигонуклеотида, состоящую из левого и правого плеч по 150 пар оснований, разделенных парой выбранных сайтов рестрикции. Также ограничьте эту область второй парой сайтов рестрикции, отличных от первой, чтобы обеспечить возможность вставки в вектор TDS после синтеза. Теперь убедитесь, что олигонуклеотид с сайтами рестрикции разработан таким образом, чтобы он находился в одной рамке считывания с желаемым сайтом вставки. При синтезе олигонуклеотида убедитесь, что сайты рестрикции, встроенные между левым и правым плечами, совпадают с сайтами, фланкирующими открытую рамку считывания выбранного флуоресцентного маркера. Внесите эти же сайты рестрикции по обе стороны флуоресцентного маркера с помощью ПЦР. Клонируйте синтезированный фрагмент в вектор TDS. Также клонируйте флуоресцентный маркер в полученный рекомбинантный вектор, используя сайты рестрикции между левым и правым плечами областей гомологии. Инфицируйте монослой клеток BS-C-one вирусом вакцины в безсывороточной среде.

Через один час после заражения перенесите клетки в модифицированную среду Игла в модификации Дульбекко. Проведите трансфекцию смесью плазмиды рекомбинационного вектора и реагентов для трансфекции в соотношении три к одному в безсывороточной среде. Через 24 часа соберите клетки методом скребка и перенесите их в среду DMEM без добавления эмбриональной телячьей сыворотки. Подвергните клетки трем циклам замораживания-оттаивания для разрушения клеток и высвобождения вирусных частиц. Затем, для обеспечения надлежащего разделения отдельных бляшек, заразите 100% конфлюэнтные монослои клеток BS-C-1 серийными разведениями препарата вирусных частиц. Нанесите слой из 10% FBS и DMEM с добавлением реагентов для селекции GPT и инкубируйте в течение 24 часов.

Откачайте жидкую среду и с помощью флуоресцентного микроскопа найдите бляшки, демонстрирующие диффузную красную флуоресценцию, что соответствует включению M-cherry из вектора TDS в вирус. В зависимости от целевого гена и выбранного флуоресцентного маркера в той же красной бляшке может также наблюдаться локализованная флуоресценция гена маркера.

Теперь выберите несколько бляшек для каждого рекомбинантного вируса, соскребите их наконечником пипетки и перенесите клетки в пробирку Eppendorf, добавив 100 µL среды DMEM, содержащей 5% FBS. Проведите три цикла замораживания-оттаивания соскребленных клеток, чтобы высвободить рекомбинантные вирусы.

Добавьте DMEM, содержащий размороженный вирус, к монослою клеток в 12-луночном планшете для амплификации рекомбинантных вирусов с использованием реагентов для селекции по GPT в ростовой среде. Затем через 24 часа после инфицирования соберите путем скребка успешно амплифицированные вирусы. Для проведения метода бляшек с целью выявления успешно амплифицированных бляшек, проявляющих красную флуоресценцию, высейте монослой клеток BS-C-one в шестилуночный планшет.

Выполните серийное разведение рекомбинантных вирусов и инфицируйте лунки, используя возрастающие разведения вирусов в среде DMEM без FBS. Через 1 час после инфицирования удалите жидкую среду и залейте каждую лунку 0,5% агарозой в полной минимальной эссенциальной среде. Через три дня после инфицирования выберите бляшки, проявляющие как красную флуоресценцию, так и флуоресценцию выбранного флуоресцентного тега.

Снова проведите амплификацию без селекции GPT. Выберите бляшки, которые утратили диффузную красную флуоресценцию, но сохранили локализованную флуоресценцию, соответствующую выбранной метке. Продолжите очистку бляшек без селекции для получения чистого стока рекомбинантных вирусов, утративших гены M-cherry и селекции GPT, но сохранивших локализованную флуоресценцию, соответствующую выбранной метке.

Оцените чистоту стоков с помощью метода анализа бляшек, стремясь к получению бляшек с однородным фенотипом. Нарастите тестовые вирусные стоки в монослое клеток BS-C-one. Через 24 часа после инфицирования соскребите инфицированные клетки в 250 µL DMEM. Центрифугируйте инфицированные клетки, удалите супернатант и ресуспендируйте клеточный осадок в 500 µL 0,1% SDS в TE-буфере. Перемешайте на вортексе для лизиса клеток. Затем добавьте 500 µL смеси фенола, хлороформа и изоамилового спирта, переверните пробирку для перемешивания. Центрифугируйте. Соберите верхнюю фазу и повторите экстракцию.

Затем для осаждения ДНК из водного слоя добавьте один миллилитр охлажденного 100% этанола и 50 µL ацетата натрия. Перемешайте путем инверсии и выдержите образец при температуре -20 °C в течение ночи. После осаждения ДНК путем центрифугирования удалите всю жидкость, высушите осадок ДНК на воздухе и ресуспендируйте его в 50 µL буфера TE. Используйте эту матрицу геномной ДНК для ПЦР-скрининга на наличие вирусной вставки. Создайте рекомбинантные вирусы с несколькими метками, как подробно описано в текстовом протоколе.

Эти рекомбинантные вирусы вакцинии экспрессируют белки, меченные флуоресцентными маркерами, которые нацелены на структурные вирусные белки A3 и F13, являющиеся компонентами внутреннего ядра и внешней оболочки вируса соответственно. Для визуализации вирусных частиц были выбраны гены, кодирующие белки, локализованные в вирионе. A3 представляет собой белок ядра вириона вакцинии, а F13 — белок вирусной оболочки.

Также показан вирус с двойной меткой, содержащий флуоресцентно меченые белки A3 и F13. С помощью такого дважды меченого вируса можно проводить флуоресцентную микроскопию в режиме реального времени. В данном случае белок внутреннего ядра вируса вакцины A3 мечен красным, а белок внешней оболочки F13 — зеленым.

Необолочечные вирусные частицы из вирусной фабрики визуализированы красным цветом, а облеченные вирионы представлены колокализацией красного и зеленого каналов. Количественный анализ использовался для определения эффективности рекомбинации между рекомбинантными векторами и геномом вируса вакцины. Эффективность гомологичной рекомбинации векторов с геномом вируса вакцины может быть обнаружена даже при наличии регионов гомологии длиной всего 70 base pair.

Данный метод использовался для создания вирусов с несколькими флуоресцентными метками и/или множественными делециями генов. Они применялись при изучении инфекционного жизненного цикла вируса, роли вирусных белков в подавлении систем защиты хозяина, а также взаимодействий с сигнальными процессами хозяина. После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как генерировать рекомбинантные вирусы vaccinia, используя метод, который отличается модульностью применяемых меток, тщательностью отбора желаемых рекомбинантов и применимостью в различных исследовательских контекстах.