Инициирование метастатического рака молочной железы с помощью таргетинга из эпителия протоков с аденовируса-Cre: роман Трансгенные мыши Модель рака молочной железы

Общая цель следующего эксперимента заключается в разработке мышиной модели рака молочной железы, который в конечном итоге метастазирует в присутствии здоровой иммунной системы. Это достигается, во-первых, путем введения аденовируса кри, экспрессирующего его, в молочный протоковый канал экспериментальных животных. Затем молочная железа регулярно пальпируется для контроля прогрессирования опухоли.

В конечном счете, метастазирование опухоли и инфильтрация лейкоцитов в подмышечный лимфатический узел могут быть оценены с помощью проточного цитометрического анализа. Основное преимущество этого метода по сравнению с существующими моделями опухолей молочной железы заключается в том, что он позволяет точно инициировать опухоли, которые могут развиваться в присутствии зрелой иммунной системы и которые можно отслеживать по экспрессии YFP. Визуальная демонстрация этого метода имеет решающее значение, так как вводные шаги инъекции трудно освоить.

Правильная постановка иглы требует точности и практики. В день проведения эксперимента храните Eloqua четыре раза по 10 восьмых бляшечных единиц аденовируса Cree на сухом льду, разморозьте вирус заданной комнатной температуры и смешайте его с достаточным количеством 3%-ной сахарозы в стерильной воде, чтобы довести итоговый объем до 10 микролитров. Далее аккуратно вмешайте в вирус 34 микролитра mem и четыре микролитра свежеприготовленного хлорида кальция и инкубируйте раствор при комнатной температуре.

Через 15 – 20 минут среда будет казаться мутной, что указывает на образование аденовирусных осадков. Аккуратно переверните пробирку, чтобы убедиться, что вирусные частицы равномерно распределены по всей суспензии, а затем для введения вирусных частиц наберите три микролитра вируса в шприц объемом 10 микролитров. Затем положите мышь под наркозом на спину на освещенный предметный столик чистого микроскопа для вскрытия.

Осветите живот дополнительным источником света и найдите левую четвертую или правую девятую паховую молочную железу по маленьким белым пятнышкам шерсти, окружающим каждый сосок. Теперь аккуратно потрите сосок стерильным аппликатором, пропитанным этанолом, ватным наконечником. Затем закрепите сосок тонкими хирургическими щипцами и потяните вверх с легкой силой.

Чтобы удалить кератиновую пробку, стабилизируйте сосок между щипцами и аккуратно введите иглу между кончиками. Канюлируя канал протока под углом 90 градусов для обеспечения надлежащей глубины инъекции, осторожно потяните иглу вверх после введения ее в просвет протока, втягивая сосок вверх по краям иглы по мере ее подтягивания. Когда игла будет правильно размещена, осторожно погрузите все содержимое шприца.

Соска должна немного надуваться по мере добавления жидкости. После инъекции поместите мышь обратно на грелку до тех пор, пока она не начнет восстанавливаться после анестезии. Затем поместите животное обратно в чистую клетку и следите за ним до тех пор, пока не будет наблюдаться полное выздоровление.

Пальпируйте инъекционную железу памяти на 30-й день для оценки увеличения и отека железы. Контролируйте прогрессирование опухоли каждые пять-семь дней. После того, как вы заметили опухшую и увеличенную молочную железу, измеряйте объемы опухоли каждые три-четыре дня для кинетики роста опухоли.

Как только появляются пальпируемые опухоли, успешное нацеливание на молочное протоковое дерево может быть визуализировано путем подготовки целых участков молочной железы после инъекции трипа и синего для проверки правильности инъекции или после инъекции аденовируса, экспрессирующего М-вишню, для проверки правильной вирусной подготовки и инфицирования пластичных эпителиальных клеток. Когда опухоли индуцируются у трансгенных мышей F Fluxed P 53 LSLK RAs, начальные опухоли не становятся очевидными примерно до 40-го дня, когда молочные железы увеличиваются и опухают. Начиная примерно с 56-го дня, опухоли начнут расти в геометрической прогрессии.

На этом этапе крайне важно измерять объемы опухоли каждые три дня. Если кинетические исследования желательны, так как будет наблюдаться некоторая нормальная вариабельность опухоли от мыши к мыши, большие образования в брюшной полости будут заметны к 80-му дню, после чего мышей следует усыпить, если опухоли превышают более 10% от массы тела животного. Анализ CDNA трех клеточных линий, полученных из опухолей молочной железы в потоке P 53 LSL KRAS трансгенных мышей, показал, что опухоли экспрессируют мезотелин цитокератин восемь, HER два новых и рецептор эстрогена альфа, аналогично клеточному микроокружению в раке молочной железы человека наблюдается инфильтрация альфа, бета и гамма дельта Т-клеток, а также миелоидных производных клеток-супрессоров и макрофагов в опухоли.

Сосудистая сеть, дренирующаяся в подмышечный лимфатический узел, начнет набухать до того, как опухоли вырастут, и в конечном итоге охватит всю ткань памяти, где была выполнена инъекция. Также будет наблюдаться явное нагрубание поверхностной эпигастральной вены между паховыми и подмышечными лимфатическими узлами. Через семь-восемь недель подмышечный лимфатический узел увеличивается из-за лимфоваскулярной инвазии опухолевых клеток.

Лимфоваскулярную инвазию и метастазирование опухолевых клеток можно отследить путем скрещивания трансгенных мышей Flock P 53 LSLK RA с мышами L-S-L-E-Y-F-P. После предварительно опосредованной эксцизии в опухоли обнаруживаются клетки, экспрессирующие как высокий, так и низкий уровни YFP, и их метастазирование может быть прослежено до дренирующего подмышечного лимфатического узла. После освоения эта техника может быть выполнена на экспериментальной когорте из 20 мышей за два-три часа, если она выполнена правильно.

После этой процедуры можно разработать другие модели опухолей путем разведения мышей с дополнительными замками, p-трансгенами, чтобы ответить на такие вопросы, как как влияние различных онкогенов на патологию, иммунное микроокружение и метастатическую инвазию рака молочной железы.