Спинномозговой жидкости профилирования микроРНК с использованием количественных ПЦР в реальном времени

Общая цель этой процедуры заключается в профилировании микроРНК в спинномозговых жидкостях с помощью количественной ПЦР и анализе данных с помощью профессионального программного обеспечения поколения X. Это достигается путем выделения общей РНК из образцов спинномозговой жидкости. Вторым шагом является выполнение обратной транскрипции для транскрипции РНК в CDNA.

Затем CDNA смешиваются с кибер-зеленой мастер-смесью, загруженной в 384 луночные планшеты, содержащие праймеры для 742 уникальных последовательностей, и амплифицируются с помощью ПЦР в реальном времени. Заключительным этапом является анализ данных, полученных в результате усиления в режиме реального времени. В конечном счете, результаты могут быть выражены в виде изменения в раз, увеличения или уменьшения по отношению к элементу управления и визуализированы в различных графических представлениях.

Таким образом, основное преимущество нашей методики перед существующими методами, такими как чиповые матрицы, заключается в том, что наш метод очень чувствителен и требует минимального количества РНК. Как правило, люди, плохо знакомые с этим методом, испытывают трудности из-за большого объема генерируемых данных и использования программного обеспечения для анализа данных. Сначала опрыскайте рабочую зону и пипетки с помощью RNA Zap.

Для начала синтез CDNA разбавляет образцы матричной РНК до концентрации пяти нанограммов на микролитр водой, свободной от нуклеазы. Затем аккуратно поместите пятикратный реакционный буфер на лед, чтобы он оттаял. Затем добавьте 40 микролитров воды, свободной от нуклеаз, в РНК-шип для ресуспендирования реагента, закрутите трубку и оставьте ее на льду на 15-20 минут.

Далее достаньте ферменты из морозилки, переверните пробирки и положите их на лед. Кроме того, как только все реагенты оттают, быстро раскрутите их. Приготовьте рабочий раствор обратной транскриптазы в 1,5-миллилитровой пробирке с ЭФГ, добавив фермент пятикратного реакционного буфера.

Смешайте воду, свободную от нуклеаз, и шип РНК в матрице, используя пропорции, указанные в таблице 1. Далее перемешиваем рабочий раствор, поворачивая его в течение одной-двух секунд на максимальной скорости. Кратковременно убавьте раствор в течение 10 секунд, а затем распределите рабочий раствор по безнуклеазным ПЦР-пробиркам.

Затем добавьте матричную РНК непосредственно в ПЦР-пробирки. Осторожно переведите реакцию на одну-две секунды, чтобы убедиться, что все реагенты тщательно перемешаны, и вращайте пробирки в течение 10 секунд. Поместите образец в ПЦР-машину и введите настройки, показанные здесь.

Затем запустите программу после ретро-транскрипции. CDNA готова к амплификации ПЦР в режиме реального времени и может храниться при температуре минус 20 градусов Цельсия до пяти недель. Чтобы начать амплификацию ПЦР в реальном времени, сначала поместите CDNA и мастер-смесь ПЦР на лед.

Чтобы оттаять, защитите флаконы с мастер-смесью PCR от света, накрыв их алюминиевой фольгой, пока они оттаивают. После оттаивания вихря мастер ПЦР перемешивает в течение одной-двух секунд. Далее соедините 2000 микролитров двух мастер-миксов XPCR и 1 980 микролитров воды в конической трубке объемом 15 миллилитров.

Добавьте в смесь 20 микролитров CDNA и аккуратно перебейте растворы в течение одной-двух секунд. Затем уменьшите растворы в охлаждаемой центрифуге при температуре 1500 G в течение одной минуты при четырех градусах Цельсия. Затем поместите смесь для реакции ПЦР в многоканальный резервуар для пипетки.

Перед снятием уплотнения пластины кратковременно уменьшите готовые к использованию пластины в охлаждаемой центрифуге при перегрузке в 1,500 раза. Затем диспонируйте по 10 микролитров мастер-смеси для ПЦР, содержащей CD NA, в каждую лунку 384-луночного планшета. С помощью 16-канальной пипетки запечатайте пластину оптической герметизирующей пленкой.

После добавления исходной смеси кратковременно прокрутите пластину в охлаждаемой центрифуге при 1,500 G для вытягивания раствора на дно лунок. Перемешайте образцы и удалите пузырьки воздуха, чтобы приостановить эксперимент. На этом этапе храните реакции в защищенном от света месте при температуре четыре градуса Цельсия в течение 24 часов.

Затем выполните амплификацию ПЦР в режиме реального времени и анализ кривой плавления в соответствии с параметрами, подробно описанными в таблице 2. Чтобы начать анализ, выберите метод анализа второй производной в светоциклере Roche. Затем рассчитайте цикл количественной оценки или значения CQ.

Экспортируйте данные в виде таблицы и сохраните ее в виде текстового файла. Далее импортируйте данные в Gen X, сначала нажав на кнопку мастера импорта gon, а затем нажав на кнопку «Старт» в следующем окне, выберите формат файлов раскладки инструментов и пластин. Файлы Excel для раскладки тарелок можно скачать с сайта GON.

Затем импортируйте первую панель и нажмите далее. Таблица, созданная после импорта файла, содержит предопределенные столбцы, отредактируйте имена образцов, а также добавьте или удалите столбцы классификации на этом шаге. Нажмите «Далее», когда закончите, и сохраните данные.

Затем загрузите его в редактор данных Сначала откалибруйте данные между пластинами, выбрав INTERPLATE calibration в меню предварительной обработки, чтобы убедиться, что все пластины рассчитаны с использованием одних и тех же параметров. Затем определите пороговое значение, при котором данные будут отбрасывать выше порогового цикла или ct. Если микроРНК имеет КТ, который больше для одной реплики из трех, это значение будет заменено средним значением КТ от двух других зондов.

Определите референсные гены, выбрав список микроРНК, которые имеют одинаковые значения CQ во всех образцах и норму гена. Далее нормализуют данные с помощью полученных референсных генов. Полученные значения будут соответствовать дельте ct.

Чтобы удалить пустые и почти пустые столбцы, откройте окно предварительной обработки и выберите пункт Проверить лист, а затем нажмите кнопку Применить в строке удаления пустых столбцов в строке ниже. Выберите желаемый процент допустимых данных и нажмите «Применить». Выберите 100%, если вы хотите сравнить только микроРНК, общие для всех образцов.

Загрузите окончательный файл MDF в Gen X и откройте менеджер данных для классификации кластера и визуализации микроРНК и образцов на тепловых картах и дендрограммах. Затем выберите и создайте группы образцов и нажмите «Применить», когда закончите. Далее в окне панели управления нажмите кнопку «Выполнить».

Сохраните тепловую карту в нужном формате, например в формате TIFF или растровом изображении, а затем скопируйте и измените тепловую карту по мере необходимости. Этот графический столбец был получен из приложения G norm в поколении X для анализа 10 возможных референсных генов микроРНК. Эти результаты указывают на то, что MIR 622 и MI 1, 266 являются наиболее стабильно экспрессируемыми микроРНК.

Показанная здесь ящичковая диаграмма показывает распределение данных для каждой из 11 статистически значимых микроРНК в группах HIVE и HIV plus без энцефалита. В каждом столбце на графике указывается медиана, первый и третий квартили, а также максимальное и минимальное значения. После этой процедуры можно проводить минеральное профилирование любых жидкостей организма, образцов тканей и культивируемых клеток.