Визуализация G3BP стресс Гранулы Dynamics в живых первичных клеток

Общей целью данного эксперимента является изучение динамики гранул рибонуклеопротеинов в первичных клетках, особенно образования стрессовых гранул. Это достигается путем культивирования таких клеток, как мышиные, эмбриональные, фибробласты или нейроны гиппокампа от животных, представляющих интерес. В качестве второго шага меченый компонент гранул напряжения трансфицируется для обеспечения их визуализации.

Затем клетки индуцируются стрессом и контролируются с помощью покадровой конфокальной микроскопии. Полученные результаты показывают динамику G трех BP, содержащих стрессовые гранулы в мифах или зеркальных нейронах и нейронах гиппокампа на основе их прямой визуализации. Эти методы могут помочь ответить на ключевые вопросы о реакции на стресс в клетках, таких как нейроны.

Например, у мышей были обнаружены нокдаун РНК, запрет белков, необходимых для стрессовых гранул, дефекты нейронов. Таким образом, этот метод может помочь понять механизмы, лежащие в основе этих наблюдений. После усыпления беременной мыши с E 13.5 продезинфицируйте мышь 90% этанолом и удалите маточные рожки под стерильным капюшоном.

Перенесите рога в температуру 37 градусов Цельсия DPBS и удалите эмбрионы. Переложите эмбрионы в 100-миллиметровую посуду. Удалите лишние салфетки и смойте их теплой DPBS.

Теперь под микроскопом удалите конечности, внутренние органы и верхнюю часть головы, в которой находится мозг. Хвостовая или головная части могут быть использованы для генотипирования. Оставшиеся салфетки пропустите через мясорубку в отдельной посуде не менее минуты.

Не объединяйте генотипы, если они должны различаться в пределах помета. Накройте ткань фарша одним x трипсином ЭДТА и инкубируйте его в течение 30 минут при температуре 37 градусов Цельсия. Далее добавляем 10 миллилитров полной среды mes.

Чтобы остановить реакцию, разрыхлите ткань с помощью пипетки и переложите полученную суспензию в 50-миллилитровую трубку. Сверху закройте тюбик медиумом и дайте содержимому осесть. Затем сцедите из подвешенных ячеек.

Далее раскрутите подвес при 300 G в течение пяти минут. При комнатной температуре реус суспензируют гранулы в шести миллилитрах готовой среды на один зародыш. Количество жизнеспособных клеток с ядром должно составлять около 5 миллионов на эмбрион

Затем загрузите в 60-миллиметровые планшеты три миллилитра клеточной суспензии и заквашивайте. Им. Смените среду на следующий день и дайте клеткам вырасти до конбистенции. Когда клетки подвергаются субкультивированию, выживают только фибробласты.

Разделите сливающиеся пластины на 35-миллиметровое стекло. Нижняя посуда. Увеличьте плавность этих блюд до 50-70% и приступайте к переливанию.

На каждую 35-миллиметровую чашку приходится три микрограмма очищенной плазмиды для трансфекции. Достаточно будет использовать имеющийся в продаже набор для трансфекции. В данном примере вектор, выражающий разрыв между RAs.

Трансфицируется трехдоменный белок, связывающий SSH. Это важный компонент стрессовых гранул. Процедура, конечно же, применима к исследованию любого вектора интереса в фибробластах за день до сбора урожая щенка.

Приготовление блюд, покрытых лизином Полины, начинается со сбора эмбрионов из 18,5 DPC dams и переноса их в HBSS в большую посуду. При желании, неонатальные щенки могут быть подставлены, чтобы предотвратить жертвоприношение матери. Разрежьте голову и удалите мозг.

Затем соберите мозги щенка в чистую чашку с HBSS под микроскопом. Удалите все мозговые оболочки с помощью тонких щипцов. Затем отделите нужные части мозга, такие как бегемот

Перенесите ткани в 4,5 миллилитра холодного ГПСС в 15 миллилитровые пробирки и держите их на льду. Переваривают ткани, добавляя 0,5 миллилитра 2,5%-ного раствора трипсина. Инкубируйте их при температуре 37 градусов Цельсия в течение 15-20 минут.

Затем промойте трипсин тремя промывками HBSS, стараясь не потерять ни одной ткани. Теперь ресуспендируйте ткани от половины до одного миллилитра ДММ с 10% FBS. Затем гомогенизируйте ткань, пропуская ее через пипетку.

Затем переключитесь на наконечник объемом 200 микролитров и пипетируйте раствор до тех пор, пока не останутся видимые агрегаты. Далее добавьте от 100 до 200 микролитров клеточной суспензии в 35-миллиметровый стакан Донышные посуды, приготовленные с помощью DMM FBS среды, инкубируйте посуду. После трех часов культивирования замените среду на предварительно подогретую нейронную полную среду на оставшееся время культивирования.

Через 5-14 дней в культуре нейроны переносят с помощью кальциево-фосфатного метода. Через 24 часа после успешной трансфекции стрессовые гранулы начнут собираться из-за сверхвысокой экспрессии G-трех BP. Дополнительное напряжение еще больше вызовет напряженную сборку гранул, предварительный нагрев компонентов конфокального микроскопа в течение не менее 20 минут, включая нагрев предметного столика до 37 градусов Цельсия.

Держатель 35-миллиметровой пластины требуется непосредственно перед визуализацией ячеек. Выполните следующие действия. Во-первых, замените любую клеточную среду, содержащую фенольный красный, на среду без фенольного красного.

Немедленно приступайте к визуализации клеток. Стрессовые гранулы сформируются менее чем за час, поэтому стресс будет вызван после визуализации клеток. Важно начать сбор данных как можно скорее после индукции стресса и точно отрегулировать два параметра в зависимости от типа вашей клетки и вашего типа белка.

Интенсивность лазера и продолжительность регистрации ниже, чем у обоих, что снижает цитотоксичность. Затем просмотрите ячейки с помощью объектива для погружения в масло 40 x и 63 x. Убедитесь, что пластина плоская в держателе и минимально используйте флуоресцентную лампу.

После того, как интересующее вас поле будет найдено, используйте программное обеспечение для получения изображений. Начните с мощности лазера на уровне 10% или меньше, а затем установите усиление и смещение, чтобы получить наилучшее возможное соотношение сигнал/шум. Сканируйте с частотой 1000 Гц, чтобы свести к минимуму воздействие лазерного стека болезней по желанию, и сохраняйте интервал сканирования как можно дольше для лучшего поддержания здоровья культуры.

Получайте данные в течение необходимого времени в MEF, гранулы формируются в течение 10 минут и хорошо видны в течение часа. В нейронах этот процесс происходит немного медленнее. G три БП должны обеспечивать достаточно сильный сигнал в течение не менее 45 минут с использованием описанных методик.

В культивируемых клетках контролировали образование стрессовых гранул. Локализация меченого G-3 БП белка была диффузной в культивируемых мифах цитоплазмы, а также диффузной в цитоплазме нейронов. При обработке арсонитами белки четко локализуются в определенных и более крупных очагах в любом типе клеток.

Это и есть стрессовые гранулы. Сделанные снимки могут быть реконструированы в покадровый фильм. На первом и втором видео показано, как фибробласты реагируют на стресс.

На третьем видео показано то же самое. В нейроне гиппокампа реконструкции Зака предлагают 3D-локализацию помеченного G three B bp и, таким образом, другой взгляд на отслеживание. После этой процедуры можно использовать иммуноцитохимический анализ для визуализации компонентов гранул после различных видов стресса и после самофиксации.

Это может ответить на количественные вопросы о размере и количестве различных клеточных тел в различных условиях.