Микрофлюидных Платформа для измерения хемотаксис нейтрофилов из необработанного цельной крови

Эта микрофлюидная технология направлена на измерение функциональности нейтрофилов человека непосредственно из одной капли крови на платформе, которая может быть мультиплексирована. Центральная загрузочная камера служит источником цельной крови, а также действует как сток для градиентов химиоаттрактанта, которые образуются из 16 фокальных хемотаксических камер. Уникальная механическая фильтрация эритроцитов позволяет исследовать функцию нейтрофилов в природном контексте крови, клеточных и биохимических компонентов.

Бифуркация между каналом, ведущим в фокальную хемотаксическую камеру, и каналом, выходящим из устройства, позволяет количественно оценить и модулировать направленность мигрирующих нейтрофилов. Таким образом, результаты могут продемонстрировать, как активно мигрирующие нейтрофилы легко мигрируют мимо захваченных эритроцитов и накапливаются в большом количестве с течением времени. Одной из уникальных особенностей наших микрофлюидных устройств является их простота в изготовлении и настройке.

Они состоят из слоя PDMS, отлитого на микропластине, которую мы приклеиваем на стеклянное дно, однолуночную или многолуночную пластину. Главное преимущество этой методики в том, что для нее требуется всего лишь капля цельной крови. Устройства могут использоваться со стандартными пипетками, не имеют движущихся частей, не требуют трубок или внешних шприцевых насосов.

Применение этого метода распространяется на клиническое применение по сравнению с тем, которое требуется при использовании традиционных методов. Наш подход занимает минуты с момента забора крови до анализа миграции нейтрофилов. Новые гребни для фильтрации эритроцитов не позволяют эритроцитам блокировать активную миграцию нейтрофилов и отличают этот метод от других микрофлюидных методов.

Для этого необходимо удалить кровь перед проведением химиотерапии. Механическое глушение эритроцитов и каналов отличает нашу технологию и позволяет тестировать нейтрофилы в нашей физиологической среде цельной крови, включая сыворотку и тромбоциты. Таким образом, технология точна и проста в использовании, и она может значительно улучшить наше понимание роли нейтрофилов и врожденной иммунной системы C. в здоровье и болезнях.

Изготовьте мастер-форму, чтобы определить каналы миграции в соответствии с инструкциями производителя Первый шаблон. Первый слой негативного фоторезиста на основе эпоксидной смолы толщиной три микрона затем моделирует второй слой 50 микрон для определения загрузки ячейки и хемокиновых камер. Теперь к отливке полиметилсоана приборы энергично перемешать 20 грамм PDMS с двумя граммами инициатора в течение пяти минут.

Осторожно вылейте PDMS на пластину с рисунком и дегасируйте в вакуумной сушке в течение одного часа. Затем выпекайте и отверждайте микрофлюидные устройства PDMS в духовке при температуре 65 градусов Цельсия в течение не менее трех часов. Чтобы убедиться, что PDMS выпекается при правильной температуре, обязательно следите за внутренней температурой духовки с помощью термометра.

Выбейте центральные камеры для загрузки цельной крови диаметром 1,5 миллиметра. Также пробивайте целые бублиообразные устройства диаметром 5,0 миллиметров. Удалите частицы из кольцевых приспособлений с помощью скотча.

Затем промойте многолуночную пластину деионизированной водой и высушите азотом, поместив пластину в духовку при температуре 60 градусов Цельсия на пять минут. Кислородная плазма обрабатывает в течение 35 секунд. Затем добавьте в пончик устройства и кислородную плазму.

Снова лечите еще 35 секунд. Аккуратно переложите приборы в углубления тарелки и запекайте скрепленными приборами на горячей плите при температуре 80 градусов Цельсия в течение 10 минут. После лечения кислородной плазмой устройство становится гидрофильным, а капиллярные эффекты могут способствовать затравливанию мелких каналов в устройстве.

Для раствора химиоаттрактанта смешайте пять микролитров 10 микромолярного FMLP с пятью микролитрами одного миллиграмма на миллилитр фибронектина и 490 микролитров HBSS. Медленно внесите раствор химиоаттрактанта в пипетку всей камеры загрузки крови и дополнительно 20 микролитров химиоаттрактанта по внешней стороне устройства. Поместите тарелку в режим сушки на 15 минут.

Подайте вакуум на устройство, чтобы заполнить устройство раствором химиоаттрактанта. Извлеките пластину из влагопоглотителя и подтвердите смачивание канала устройства постепенным уменьшением размера пузырька воздуха. Затем тщательно промойте всю камеру загрузки крови и внешнюю часть устройства, чтобы удалить излишки раствора химиоаттрактанта.

Далее необходимо создать градиент химиоаттрактанта от каждой из фокальных хемотаксических камер к центру устройства. Аккуратно введите 100 микролитров PBS в отверстие так, чтобы капля PBS образовалась на верхней части устройства. Наклоните пластину и пипетку: один миллилитр PBS обойдите устройство, чтобы собрать на дно лунки жидкость, отаскайте жидкость и повторите промывку PBS три раза.

Затем заполните каждую лунку средой, чтобы погрузить устройства в воду, и дайте 15 минут, чтобы градиент стабилизировался. Затем медленно накачайте пипеткой по два микролитра цельной крови в каждую камеру загрузки цельной крови. Для сбора крови из пальца вымойте руки водой с мылом.

Подсушите кожу в качестве антикоагулянта раствором для пятен. Добавьте один миллилитр 0,2% HSA и 10 микролитров 32,4 микромолярных крючков. Прикрасьте пробиркой для сбора крови гепарин, уколите здоровый палец донора и сотрите первую каплю крови.

Соберите 50 микролитров крови в раствор антикоагулянта для окрашивания и аккуратно перемешайте. Настройте биокамеру на 37 градусов Цельсия, 80% влажности и 5% CO2. Немедленно начните покадровую съемку с увеличением 10 или выше для значимого статистического анализа, вручную отслеживайте не менее 50 нейтрофилов в каждом образце.

Подсчитайте количество клеток, поступающих в фокальные камеры хемотаксиса с течением времени. Затем с помощью изображения J рассчитайте скорости нейтрофилов в канале между WBLC и FCC. Затем, чтобы количественно оценить направленность нейтрофилов, подсчитайте количество клеток, которые проходят бифуркацию, и вычислите соотношение между числом клеток, которые поворачиваются к фокальным камерам хемотаксиса, и клетками, которые выходят из устройства.

Клетки, которые не являются направленными, не следуют хемотаксическому градиенту и, следовательно, мигрируют в равных количествах к FCC и выходному каналу. В этом эксперименте анализ хемотаксиса нейтрофилов всей крови был валидирован путем измерения накопления нейтрофилов в направлении градиента FMLP. Результаты подтверждают, что эритроциты захватываются фильтрационным гребнем, в то время как нейтрофилы способны активно мигрировать из цельной крови.

Стабильный линейный градиент химиоаттрактанта, образованный микрофлюидным устройством для цельной крови, был подтвержден с использованием меченного декстрана FSE, а уровни флуоресценции измерялись с течением времени. Результаты, полученные с использованием новой платформы WB Chemotaxis, показывают, что нейтрофилы из всех источников крови мигрируют с постоянной скоростью и с одинаковым общим количеством мигрирующих клеток. Важно отметить, что эта система позволяет количественно определять нейтрофилы, что отличает хемотаксис от химиокинеза.

Встраивание нашего устройства в 12 или 24-луночный планшет с использованием стандартных методов чистых помещений, оборудования, скрининг нескольких условий одновременно. Используя этот метод, мы можем измерить скорость и направленность нейтрофилов на уровне одной клетки. В отличие от традиционных методов, которые измеряют массовую миграцию клеток конечных точек, не забывайте тщательно подготавливать микрофлюидное устройство и медленно загружать оба образца, чтобы эритроциты не выталкивались за пределы композиции устройства.

Описанный протокол особенно полезен для измерения хемотаксических дефицитов переходных нейтрофилов, позволяя проводить повторные выборки в течение нескольких временных точек, но также может быть адаптирован для измерения миграции других типов клеток от различных модельных организмов. Этот метод может дать представление о временных изменениях функциональности нейтрофилов у пациентов с различными состояниями, связанными с более высокой частотой инфекций, в том числе у пациентов с травмами, пациентов после обширных операций и онкологических больных, получающих химиотерапию.