Микрофлюидных Платформа для измерения хемотаксис нейтрофилов из необработанного цельной крови

Данная микрофлюидная технология предназначена для измерения функциональности нейтрофилов человека непосредственно из одной капли крови на платформе с возможностью мультиплексирования. Центральная загрузочная камера служит источником цельной крови, а также выступает в роли стока для градиентов хемоаттрактантов, которые формируются в 16 фокальных хемотаксических камерах. Уникальная механическая фильтрация эритроцитов позволяет исследовать функцию нейтрофилов в естественном контексте крови, ее клеточных и биохимических компонентов.

Разветвление канала, ведущего к фокальной хемотаксической камере, и канала, выходящего из устройства, позволяет количественно оценить и модулировать направленность миграции нейтрофилов. Таким образом, результаты могут продемонстрировать, как активно мигрирующие нейтрофилы легко перемещаются мимо заблокированных эритроцитов и постепенно накапливаются в камере. Одной из уникальных особенностей наших микрофлюидных устройств является простота их изготовления и настройки.

Они состоят из слоя PDMS, отлитого на микроfabricated-пластине, которую мы приклеиваем к стеклянному дну одно- или многолуночного планшета. Основным преимуществом данного метода является то, что для него требуется всего одна капля цельной крови. Устройства можно использовать со стандартными пипетками; они не имеют движущихся частей и не требуют использования трубок или внешних шприцевых насосов.

Значимость данной методики в клиническом применении выше по сравнению с традиционными методами. Наш подход позволяет сократить время от момента забора крови до проведения анализа миграции нейтрофилов до нескольких минут. Инновационные фильтрующие гребенки для эритроцитов предотвращают блокирование активной миграции нейтрофилов эритроцитами, что отличает данный метод от других микрофлюидных методов.

Это требует удаления крови перед проведением химиоанализов. Механическая блокировка эритроцитов и каналов отличает нашу технологию и позволяет тестировать нейтрофилы в физиологической среде цельной крови, включая сыворотку и тромбоциты. Таким образом, данная технология точна и удобна в использовании, и она может значительно углубить наше понимание роли нейтрофилов и врожденной иммунной системы при состояниях здоровья и заболеваниях.

Изготовьте мастер-форму на кремниевой подложке для формирования миграционных каналов в соответствии с инструкциями производителя First pattern. После нанесения первого слоя негативного фоторезиста на эпоксидной основе толщиной 3 мкм сформируйте второй слой толщиной 50 мкм для определения камер загрузки клеток и камер с хемокинами. Для отливки устройств из полиметилсилоксана (PDMS) тщательно перемешивайте 20 г PDMS с двумя граммами инициатора в течение пяти минут.

Осторожно вылейте PDMS на структурированную пластину и удалите пузырьки воздуха в вакуумном эксикаторе в течение одного часа. Затем запекайте и отверждайте микрофлюидные устройства из PDMS в печи при температуре 65 °C не менее трех часов. Чтобы убедиться, что запекание PDMS происходит при правильной температуре, обязательно контролируйте внутреннюю температуру печи с помощью термометра.

Вырежьте центральные отверстия для загрузки цельной крови диаметром 1,5 мм. Также вырежьте кольцеобразные устройства диаметром 5,0 мм. Удалите частицы из кольцевых устройств с помощью адгезивной ленты.

Затем промойте многолуночную планшетку деионизированной водой и высушите азотом после помещения планшетки в печь при 60 °C на пять минут. Обработайте кислородной плазмой в течение 35 секунд. Затем установите устройства-«пончики» и снова обработайте кислородной плазмой.

Повторно подвергните обработке в течение еще 35 секунд. Осторожно перенесите устройства в лунки планшета и запекайте соединенные устройства на нагревательном планшете при температуре 80 °C в течение 10 минут. После обработки кислородной плазмой устройство становится гидрофильным, и капиллярные эффекты могут способствовать заполнению малых каналов устройства.

Для приготовления раствора хемоаттрактанта смешайте 5 µL 10 µM FMLP с 5 µL фибронектина в концентрации 1 mg/mL и 490 µL HBSS. Медленно внесите раствор хемоаттрактанта с помощью пипетки в камеру для загрузки цельной крови, а дополнительные 20 µL хемоаттрактанта нанесите вокруг внешней части устройства. Поместите планшет в эксикатор на 15 минут.

Создайте вакуум в устройстве, чтобы заполнить его раствором хемоаттрактанта. Извлеките планшет из эксикатора и убедитесь, что канал устройства смочен, по постепенному уменьшению размера пузырька воздуха. Затем тщательно промойте камеру для загрузки цельной крови и внешнюю поверхность устройства, чтобы удалить излишки раствора хемоаттрактанта.

Затем создайте градиент хемоаттрактанта от каждой из фокальных хемотаксических камер к центру устройства. Осторожно введите 100 µL PBS в отверстие так, чтобы на поверхности устройства образовалась капля PBS. Наклоните планшет и пипеткой нанесите 1 мл PBS вокруг устройства, чтобы жидкость собралась на дне лунки; аспирируйте жидкость и повторите промывку PBS три раза.

Затем наполните каждую лунку средой так, чтобы устройства были полностью погружены, и подождите 15 минут для стабилизации градиента. После этого медленно внесите пипеткой 2 µL цельной крови в каждую камеру для загрузки цельной крови. При сборе крови из пальца предварительно вымойте руки с мылом и водой.

Просушите кожу в качестве раствора для антикоагуляционного окрашивания. Добавьте 1 мл 0,2% HSA и 10 µL 32,4 µM хуков. Для окрашивания в пробирку для сбора крови с гепарином проколите палец здорового донора и удалите первую каплю крови.

Соберите 50 µL крови в раствор антикоагулянта с красителем и осторожно перемешайте. Настройте биокамеру на 37 °C, влажность 80% и 5% CO2. Немедленно начните таймлапс-визуализацию при увеличении 10x или выше; для получения значимого статистического анализа вручную отследите не менее 50 нейтрофилов в каждом образце.

Подсчитайте количество клеток, поступающих в камеры фокального хемотаксиса с течением времени. Затем с помощью ImageJ рассчитайте скорость нейтрофилов в канале между WBLC и FCC. Для количественной оценки направленности движения нейтрофилов подсчитайте количество клеток, проходящих через точку бифуркации, и рассчитайте соотношение между количеством клеток, повернувших в сторону камер фокального хемотаксиса, и количеством клеток, покинувших устройство.

Клетки, не обладающие направленным движением, не следуют хемотаксическому градиенту и, следовательно, мигрируют в равном количестве в сторону FCC и выходного канала. В данном эксперименте анализ хемотаксиса нейтрофилов цельной крови был подтвержден путем измерения накопления нейтрофилов в направлении градиента FMLP. Результаты подтверждают, что эритроциты задерживаются фильтрационной гребенкой, в то время как нейтрофилы способны активно мигрировать из цельной крови.

Стабильный линейный градиент хемоаттрактанта, созданный в микрофлюидном устройстве для цельной крови, был подтвержден с использованием декстрана, меченного FSE, при этом уровни флуоресценции измерялись с течением времени. Результаты, полученные с помощью новой платформы WB Chemotaxis, показывают, что нейтрофилы из всех источников крови мигрируют с одинаковой скоростью, и общее количество мигрирующих клеток при этом схоже. Важно, что эта система позволяет количественно определить число нейтрофилов, тем самым дифференцируя хемотаксис от хемокинеза. После освоения метода его выполнение при правильном подходе занимает менее 10 минут.

Интеграция нашего устройства в 12- или 24-луночный планшет с использованием стандартных методов и оборудования чистых помещений позволяет проводить одновременный скрининг нескольких условий. С помощью данной методики мы можем измерять скорость и направленность движения нейтрофилов на уровне отдельных клеток, в отличие от традиционных методов, измеряющих общую конечную миграцию клеток. Помните о необходимости тщательной подготовки микрофлюидного устройства и медленной загрузки обоих образцов, чтобы эритроциты не были вытеснены за пределы рабочей области устройства.

Описанный протокол особенно полезен для измерения транзиторного дефицита хемотаксиса нейтрофилов, что позволяет проводить повторный отбор проб в нескольких временных точках, однако его также можно адаптировать для измерения миграции других типов клеток из различных модельных организмов. Данный метод позволяет получить представление о временных изменениях функциональности нейтрофилов у пациентов с различными состояниями, связанными с повышенной частотой инфекций, включая пациентов с травмами, пациентов после обширных хирургических вмешательств и онкологических больных, проходящих химиотерапию.