Тестирование

Общая цель данной процедуры — предоставить простой метод анализа с использованием Y-образного лабиринта для проверки обоняния у Drosophila melanogaster. Это достигается путем предварительного голодания мух в течение 16–18 часов, чтобы стимулировать их к исследованию новой среды с летучими стимулами. Вторым этапом процедуры является сборка установки Y-образного лабиринта, содержащей источники запахов на фильтровальной бумаге, например, уксусную кислоту в растворителе в сравнении с одним растворителем.

Третьим шагом является быстрый и осторожный перенос мух в загрузочный флакон. Через несколько часов следует финальный этап — определение местоположения мух в лабиринте. В конечном итоге полученные с помощью Y-образного лабиринта данные позволяют выявить реакцию на одорант.

Идея этого метода возникла у нас, когда мы решили создать простой и недорогой способ тестирования обонятельной реакции мух. Преимущество данной техники перед другими вариантами заключается в том, что она позволяет мухам принять решение без избыточного стресса. Процедуру продемонстрирует Меган Саймон, аспирантка моей лаборатории. Для данного протокола подготовьте изогенную линию мух со стабильными, выраженными поведенческими фенотипами. Любая такая линия может служить референтным контролем для обонятельного теста; для каждого генетического штамма, используемого в эксперименте, проведите возвратное скрещивание со штаммом-референсом в течение пяти поколений.

Для каждого обратного скрещивания спаривайте одну самку экспериментального штамма с несколькими изогенными самцами. Для проведения экспериментов по изучению обоняния содержите дрозофил на стандартной кукурузной среде с добавлением антибиотика при световом цикле 12/12 и температуре 25 °C.

Эксперименты следует всегда проводить при температуре 25 °C и при освещении в дальнем красном спектре, невидимом для drosophila. Также должна быть предусмотрена возможность полного проветривания помещения между экспериментами перед проведением анализа на следующее утро. В конце дня перенесите когорты от 10 до 20 экспериментальных линий в стеклянные флаконы, обеспечив влажность с помощью влажного полотенца.

Тестирование мух необходимо провести через 16–18 часов, иначе на следующий день они могут погибнуть от обезвоживания или голодания. Соберите Y-образный лабиринт. Начните с соединения Y-образного коннектора с двумя стеклянными флаконами с помощью пенных переходов с обрезанными наконечниками пипеток; они образуют каналы, которые за счет своей конической формы становятся проходами с односторонним движением.

Третье ответвление Y-образного соединителя прикреплено к загрузочной трубке, изготовленной из широкой части наконечника пипетки, которая обеспечивает проход из флакона для загрузки к точке выбора в лабиринте. За каждым сужающимся туннелем находится стеклянный флакон, один из которых должен быть заполнен порцией одоранта. Эти порции представляют собой болюсы объемом 40 µL, впитавшиеся в квадраты из бумажных салфеток размером 28 мм.

Для проведения теста необходимо случайным образом чередовать, в каком из двух рукавов будет находиться одорант. Охладите мух на льду в течение короткого времени, чтобы замедлить их активность. При освещении дальним красным светом от светодиодных ламп и температуре 25 °C осторожно перенесите группу мух в загрузочный флакон, а затем поместите тестовых мух в Y-образный лабиринт.

Не используйте газовую анестезию. Крайне важно перенести мух в загрузочный флакон быстро и осторожно. Это самый сложный этап эксперимента, так как мухи должны быстро проснуться до того, как остальные распределятся по Y-образному лабиринту.

Мухам следует дать возможность исследовать лабиринт в течение 24 часов, чтобы максимальное количество особей переместилось в один из стеклянных флаконов. Количество мух в разных трубках используется для расчета ольфакторного индекса. К полученному значению, рассчитанному на основе поведения до 10 мух, следует применить стандартные статистические методы.

Если 10 когорт мух не обеспечивают стабильных результатов, испытания можно провести с 20 когортами мух. Чтобы очистить компоненты лабиринта, замочите их в разобранном виде в растворе RBS 35 MD на ночь. После этого промойте их проточной водой, а затем окончательно промойте деионизированной водой перед сушкой на воздухе.

Стандартные реакции на одорант при использовании Y-образного лабиринта включают притяжение, безразличие или избегание. Например, мухи strongly avoid 10% acetic acid, в то время как они не избегают 10% pheno acetic acid.

При выполнении данной процедуры важно помнить, что этот тест с использованием воздушного потока представляет собой искусственную среду для мух. После проведения данной процедуры в качестве метода можно выполнить такие тесты, как тесты в арене с напарниками или внутренние тесты, чтобы подтвердить обонятельные реакции мух в различных условиях. После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как просто протестировать обонятельные реакции Drosophila melanogaster с помощью теста SW.